上QQ阅读APP看书，第一时间看更新
三、蛋白质分离纯化方法
(一)沉淀法
是采取适当措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取成分和其他成分分开的技术，也称溶解度法。沉淀是一不固定形的颗粒，除含有目标蛋白外，还夹杂其他杂蛋白、盐等，构成成分复杂，一般常用于蛋白的初步提纯。常用的沉淀法包括盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、聚乙二醇沉淀法、选择性变性沉淀法等多种方法，可根据蛋白的不同性质选择。下面以盐析法为主，介绍各种沉淀方法。
1.盐析沉淀法
蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电层结构，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。当加入盐时，盐会电离成离子态，溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，破坏了蛋白质的双电层结构，发生凝集而沉淀析出。不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使不同蛋白质成分分别析出。盐析法是最早使用的生化分离手段之一，具有安全、经济、不需特殊设备、操作简便、不易引起蛋白质变性等优点。但盐析法分辨率不高，沉淀物中含有大量盐析剂，后期的纯化衔接有条件性，因此一般用于破碎后蛋白的初步分离。盐析法分离蛋白质有两种方法：一种即在一定pH和温度条件下改变离子强度进行盐析（Ks分级盐析法），这种方法可使被盐析物质溶解度剧烈下降，易产生共沉淀现象，分辨率不高，常用于蛋白质的粗分离；另一种方法是在一定离子强度下改变pH和温度进行盐析（β分级盐析法），这种方法可使被盐析物质溶解度变化缓慢且变化幅度小，分辨率较高。
（1）盐析沉淀的影响因素 1）无机盐的种类：
在相同离子强度下，不同种类盐对蛋白质的盐析效果不同。一般离子半径小而带电较多的阴离子的盐析效果较好，如高价盐离子盐析作用较低价盐强，阴离子比阳离子盐析作用好。常见阴离子盐析作用顺序为 
＞ 
＞F -＞CH 3COO -＞Cl -＞Br -＞ 
＞ 
＞I -＞SCN -；常见阳离子盐析作用顺序为Al 3＋＞H ＋＞Ca 2＋＞NH 4 ＋＞K ＋＞Na ＋＞Mg 2＋。
＞ ＞F -＞CH 3COO -＞Cl -＞Br -＞ ＞ ＞I -＞SCN -；常见阳离子盐析作用顺序为Al 3＋＞H ＋＞Ca 2＋＞NH 4 ＋＞K ＋＞Na ＋＞Mg 2＋。
选择盐析用无机盐时要考虑以下几点：有足够大溶解度，能配制高离子强度盐溶液，且溶解度受温度影响应尽可能小；盐析作用要强。一般选择多价阴离子盐；在生物学上是惰性的，不影响蛋白质等生物大分子的活性；来源丰富、经济、安全。
蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等（表4-11）。
表4-11 常用中性盐在水中的溶解度%（g/100ml）
在蛋白质盐析中，硫酸铵是最常用的中性盐，它溶解度大且受温度影响小（25℃时饱和溶液为4.1mol/L，即767g/L；0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），不易引起蛋白质（酶）变性，价廉易得。但硫酸铵水解后使溶液pH降低，在高pH下释放氨气，腐蚀性强，后处理困难。一般硫酸铵溶液调高pH时选用氨水溶液。其他盐析剂如硫酸钠、氯化钠、磷酸盐等，具有较强的缓冲能力，但其溶解度随温度变化明显，常达不到使蛋白质析出的浓度。与硫酸铵相比价格贵、溶解度低且易与某些金属离子生成沉淀，所以应用受限。
2）盐离子浓度：
当盐离子浓度较低时，可促进蛋白质分子与水分子间的作用，使蛋白质溶解度增大；当盐浓度达到某一值后，随盐浓度的增加，蛋白质溶解度不断降低。因此，采用盐析方法时，盐离子要达到一定浓度，蛋白质才能沉淀析出。
3）溶质浓度的影响：
在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低，越容易沉淀，但其他成分也随目的蛋白一起沉淀出来即发生共沉淀现象，使分辨率降低。相反，溶液中蛋白质浓度过低时，虽共沉淀作用小，分辨率较高，但反应体积加大，所需用盐量增加，蛋白质回收率降低。因此盐析前首先要调节蛋白质溶液的浓度，一般常将蛋白质溶液浓度控制在2.0%～3.0%（g/100ml）较为适宜。
4）温度的影响：
大多数情况下，在一定温度范围内，物质的溶解度随温度的增加而增加，但溶液的离子强度增加后，可能会出现相反的现象。盐析时的温度选择应以不影响蛋白质的活性为准则。由于高浓度盐溶液对蛋白质有一定保护作用，除对温度敏感的蛋白质在低温（0～4℃）操作外，一般可在室温中进行。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25℃）比0℃时溶解度低，更容易盐析。
5）pH的影响：
蛋白质表面所带静电荷越多，分子间的排斥力越强，生物分子不容易聚集，溶解度就越大。当表面静电荷为零时即在等电点时，分子间的排斥力小，易聚集沉淀，此时溶解度最低。因此在不影响蛋白质的活性的情况下，往往选择pH在目的物等电点附近。这样既可减少中性盐的消耗，又提高了蛋白收率，同时也可减少共沉作用。同时希望溶液中目的蛋白不被析出，也可选择溶液的pH偏离该成分的等电点远一些。
（2）盐析的操作方法：
硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用，又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为最常用的蛋白质盐析沉淀剂。硫酸铵的加入方式分两种，即直接加入固体硫酸铵法和加饱和硫酸铵溶液法。
1）直接加入固体硫酸铵法：
在大规模生产过程中，溶液体积大或所需硫酸铵的浓度较高时，可采用这种方式，以减少溶液体积的变化。在操作过程中，首先应将固体硫酸铵研成细粉，加入速度不宜太快，少量多次分批加入，并充分搅拌使其完全溶解，防止局部浓度过高。搅拌过程应温和，防止蛋白质起泡变性。为达到所需的饱和度，加入硫酸铵质量可按式（4-2）计算：
式（4-2）中， W为1L溶液应加入硫酸铵质量（g）； G为饱和溶液中含盐量，0℃时为515g，20℃时为513g； S 1、 S 2为初始溶液和最终溶液的饱和度（%）； A为常数，0℃时为0.227，20℃时为0.29。
2）加饱和硫酸铵溶液法：
硫酸铵的饱和浓度为4.1mol/L（即767g/L，25℃），饱和硫酸铵配制方法为加入过量的硫酸铵，如取800～850g硫酸铵分批加入到1000ml水溶液中，加热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天，有固体析出时即达100%饱和度。一般饱和硫酸铵溶液的pH在4.5～5.5之间，需用氨水或硫酸调节pH后备用。加入饱和硫酸铵体积可按式（4-3）计算：
式（4-3）中， V为应加入硫酸铵饱和溶液体积（L）； V 0为蛋白质溶液的原始体积（L）； S 1、 S 2为初始溶液和最终溶液的饱和度（%）。
加饱和硫酸铵溶液法，通常在实验室或小规模生产或硫酸铵浓度不需要太高时，可采用这种方式，它可以防止溶液局部浓度过大，但溶液体积往往被增大，不利于下一步分离纯化（表4-12，表4-13）。
表4-12 25℃时硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度时，每升硫酸铵水溶液应加硫酸铵的克数
表4-13 0℃时硫酸铵水溶液由原来的饱和度达到所需饱和度时，每升硫酸铵水溶液应加硫酸铵的克数
对分离目的蛋白的盐析操作，分级盐析法是最适宜的方法。它通过改变盐的浓度与溶液的pH，可将混合液中的不同性质的蛋白逐步分开。具体操作实例如下：首先要进行试验探索，如：先进行0～30%的硫酸铵沉淀，再进行30%～60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%～80%的硫酸铵沉淀；每一段盐析静置之后都离心，将上清和沉淀分别进行电泳。通过试验结果可以看出哪一段盐析出来的目的产物最多，相对来说杂质就更少。比如试验中的目标蛋白主要在60%～80%这段出来，那么就可确定在0～60%的硫酸铵沉淀可以抛弃，然后进行60%～80%的硫酸铵沉淀并将其收集进行下一步纯化工作。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，在低温中进行，并每隔4～6小时更换缓冲液。该法透析所需时间长，缓冲液的体积需求量大。也可用葡萄糖凝胶G-25、G-50或S-100等凝胶过滤除盐；也可直接串联疏水柱层析方法进行进一步纯化。
2.有机溶剂沉淀法
亲水性的有机溶剂能降低溶液的介电常数从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低，易聚集形成沉淀；另外，有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，能破坏蛋白质的水化膜，降低了它的亲水性，导致脱水聚集。该法易于沉淀分离，分辨力比盐析法好，溶剂易除去，但容易引起蛋白质变性。它常用于蛋白质或酶的提纯，使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
影响有机溶剂沉淀因素：
（1）有机溶剂的种类和用量：
选择的有机溶剂一般能与水无限混合，介电常数小，沉淀作用强，毒性小，易于去除，最重要的是不能使蛋白质变性失活。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等，其中乙醇由于无毒、沉淀作用强、易于去除，而广泛应用。进行有机溶液沉淀时，欲使溶液达到一定有机溶剂浓度，需加入的有机溶液的体积可按式（4-4）计算：
式（4-4）中， V为需要加入有机溶液的体积（L）； V 0为原溶液体积（L）； S 1、 S 2：原溶液中有机溶液的浓度和需要达到的有机溶液的浓度（%）。
（2）温度的影响：
有机溶剂与水混合时会释放热量，因此操作过程中应先将蛋白质溶液冷却，并将有机溶剂冷却至更低温度（一般-10℃以下），并在充分搅拌下缓慢加入有机溶剂，避免温度升高及局部浓度过高引起蛋白质变性。一般沉淀0.5～2小时后即进行沉淀分离，并真空抽出残余有机溶剂或加入大量缓冲液进行稀释。
（3）pH的影响：
溶液的pH尽量在目的蛋白的等电点附近，可增加沉淀效果。但pH选择首先要考虑蛋白的稳定性，同时还要使溶液中大多数蛋白质带有相同电荷，避免共沉淀现象的发生。
（4）样品的浓度的影响：
样品的浓度较高时易产生共沉淀现象，分辨率不高；而样品的浓度过稀，溶剂用量大，样品收率低。一般将蛋白质溶液浓度控制在1.0%～2.0%（g/100ml）较为适宜。
（5）离子强度的影响：
较少的无机盐可以起到助沉剂，甚至保护蛋白质的作用。常用的无机盐为单价盐如氯化钠、醋酸钠、醋酸铵等，离子浓度一般为0.01～0.05mmol/L。当溶液中盐浓度较高时（0.2mmol/L以上），会增加蛋白质的溶解度，增加有机溶剂的加入量。因此当溶液中无机盐的含量较高时应先除盐。
（6）某些金属离子的影响：
某些多价阳离子能与蛋白质形成复合物，使得其溶解度大大降低，使沉淀更加完全，减少有机溶剂的用量。常用的有硫酸铜、硫酸锌、醋酸锌等试剂。使用过程中，常先去除杂蛋白，再加入金属离子。
3.等电点沉淀法
是利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降、易产生聚集的原理进行沉淀分级的方法。可根据不同蛋白质的等电点差异进行分离，操作简单，成本低，引入的外来杂质少，是一种常用的分离纯化方法。该法操作需要在低离子浓度下调整溶液的pH，一般适用于疏水性较强、在等电点时溶解度很低的蛋白质，而对亲水性很强的物质，由于在水中溶解度较大，仍不易产生沉淀。而且在等电点时，蛋白质一般沉淀不完全，同时许多蛋白质的等电点十分接近，故单独使用此法收率低、分辨力差，效果不理想。一般多用于将蛋白质等电点相距较大的杂蛋白去除，实际工作中常把等电点沉淀和盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用。
4.聚乙二醇沉淀法
聚乙二醇（PEG）是一种水溶性的非离子型高分子聚合物，它能够降低蛋白质水和作用，增强生物分子之间的静电引力引起沉淀，同时聚乙二醇具有空间排斥作用，将生物分子“挤压”到一起而引起沉淀。PEG的添加量与蛋白质的分子量相关，分子量越高，沉淀所需加入的PEG量越少。该法操作时，同样受温度、离子强度、pH、浓度等多种因素的影响。一般选用的PEG分子量应大于4000，常用分子量为6000～20 000，浓度为20%。聚乙二醇的去除常采用吸附法或沉淀法，将其与目的蛋白分离。
5.选择性变性沉淀法
选择性变性沉淀法是根据混合物溶液中各种分子在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，选择适当的条件（具有一定的极端性），使欲分离的成分存在于溶液中，而且保持其活性，其他成分（即杂质）由于环境的变化而变化，从溶液中沉淀出来，从而达到纯化有效成分的目的。常用的选择性变性沉淀法有热变性沉淀法和酸碱性沉淀法。
6.其他沉淀方法
一种是成盐沉淀法，它是根据生物大分子与小分子金属离子或有机酸类可以生成盐类复合物沉淀，从而进行分离。但可能会使蛋白质发生不可逆沉淀，使用该法时须谨慎。另一种是亲和沉淀法，它是利用亲和反应的原理，可选择性与目的蛋白结合形成复合物，从而进行分离。
(二)色谱分离技术
色谱分离（chromatographic resolution，CR）又称层析分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。该法利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如分子极性、分子形状和大小、等电点、分子亲和力、疏水性等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。近几十年来，色谱技术得到飞速发展，因其分离效率好、灵敏度高、选择性强、分离速度快、重复性好及实现自动化操作已成为生物物质分离和纯化技术的关键组成部分，是生物下游加工过程最重要的纯化技术。常用的色谱介质及其原理和应用如表4-14所示。常用纯化术语解释如表4-15所示。
表4-14 适用于规模化分离纯化得主要色谱方法
续表
表4-15 常用纯化术语解释
1.凝胶过滤层析
凝胶过滤层析（gelfiltrationchromatography，GFC）是以多孔性物质作固定相，根据样品分子大小不同从而达到分离的一种液相层析法。样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附、分配和离子交换等），因而凝胶过滤层析又常被称作凝胶扩散层析、体积排阻层析、分子筛层析等。凝胶过滤层析具有许多优点，介质为不带电荷的惰性物质，与被分离物质间无相互作用，因此分离条件温和，回收率高，重现性好；分离范围广，可分离从几百到数百万分子量的物质；设备简单，易于操作，可进行连续分离。但也存在分辨率不高、流速慢、受到上样体积限制等缺点。一般在盐析、浓缩后进行柱层析或往往用于目的蛋白的精细分离。目前广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、多糖及酶等生物物质的分离纯化，相对分子量的测定及去除相关杂质如热原、盐类及其他小分子试剂。
（1）凝胶过滤层析原理：
凝胶过滤层析的基本原理是含有尺寸大小不等的样品进入色谱柱后，比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，与流动相一起流出色谱柱；比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的概率越大，在固定相中停留（保留）的时间也就越长。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子移动减慢，从而根据样品分子量大小的不同由大到小依次从柱内流出达到分离目的。
凝胶过滤层析是在装有惰性多孔物质填料的玻璃柱中进行的。 V t为凝胶柱床体积； V 0为凝胶柱床中凝胶颗粒间的空隙体积或外水体积； V i为柱中凝胶颗粒内部所含液相体积，称内水体积； V g为凝胶颗粒所占体积。 V t为 V 0、 V i、 V g之和，即
式（4-5）中， R为柱子内半径； h为凝胶柱床高。
对某种物质在凝胶柱内的洗脱体积 V e与 V 0、 V i之间的关系可用式（4-6）表示，即：
式（4-6）中 K d为排阻系数或分配系数，反映物质分子进入凝胶颗粒程度。当 K d=1时，说明该物质分子量最小，完全在凝胶颗粒内部扩散，最后被洗脱下来，洗脱体积最大；当 K d= 0时，说明该物质分子量最大，完全不能进入凝胶颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称全排阻，最先洗脱下来，洗脱体积最小，等于外水体积；当0＜ K d＜1时，说明溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散；若 K d＞1，则说明该物质分子与凝胶有吸附作用。
（2）凝胶过滤介质：
凝胶过滤介质按骨架分为多糖类及树脂类。多糖类主要为纤维素、葡聚糖及琼脂糖等，树脂类包括聚丙烯酰胺系、聚乙烯醇系等。作为凝胶过滤介质应具备以下条件：介质本身应为惰性物质，不与溶质、溶剂发生任何作用，亲水性高；稳定性好，耐受较宽的pH和离子强度及压力环境；凝胶颗粒大小均匀，介质内孔径大小分布要均匀。
目前已商品化的凝胶过滤介质品种主要有：
1）葡聚糖凝胶系列：
葡聚糖是应用广泛的一类软凝胶，商品名为Sephadex。它是葡聚糖（右旋糖酐）与交联剂环氧氯丙烷交联而成的葡聚糖珠状凝胶。交联度决定凝胶孔穴大小，影响凝胶性能、分离范围及效果。G型凝胶系列产品中，G后面的数字代表交联度，数字越大交联度越小，网孔越大，排阻极限亦越大，适合于分离分子量高的产品；数字越小交联度越大，网孔越小适合于分离分子量低的产品。此外，该数字也代表凝胶持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5ml，G-100表示1g干胶持水10ml，依此类推。凝胶粒度分为粗、中、细、超细四种，由粗到细分辨率高，但流速变慢。
葡聚糖凝胶的化学性质较为稳定，在酸、碱溶液中稳定；可120℃高压灭菌30分钟不被破坏。常用的保存方法有湿法、干法、半缩法。湿法保存可在一定量的防腐剂或抑菌剂如0.02%叠氮钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇或0.25mol/L氢氧化钠等溶液中4℃短期保存；干法保存一般用浓度逐渐升高的乙醇分步处理（如20%～80%），使其脱水收缩，再抽滤除去乙醇，用60～80℃暖风吹干后可在室温保存，但处理不好凝胶孔径可能略有改变；半缩法保存可用60%～70%乙醇使凝胶部分脱水收缩，4℃短期保存。G型凝胶系列产品如表4-16所示。
表4-16 葡聚糖凝胶规格及性能
2）修饰葡聚糖凝胶：
Superdex系凝胶由高交联度的多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成，具有良好的理化稳定性，可在pH3～12范围内使用。8mol/L脲或去污剂对该系列凝胶无影响（表4-17）。
表4-17 Superdex系凝胶规格及性能
Sephacryl系凝胶由丙烯烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成，具有良好的理化稳定性，可在pH2～11范围内使用，可耐高压灭菌（pH7.0），可耐受去污剂、6mol/L盐酸胍等洗脱液处理（表4-18）。
表4-18 Sephacryl系凝胶规格及性能
续表
3）琼脂糖凝胶：
琼脂糖凝胶来源于海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，其结合力仅为氢键，键能较弱。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异。瑞典商品名为Sepharose，英国为Sagavac，美国为Bio-Gel，丹麦为Gelarose，国内琼脂糖凝胶为Sepharose B系列。它与葡聚糖不同，凝胶孔径不是由交联度决定，而是依赖琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶化学稳定性较差，凝胶颗粒的强度很低，一般只能在pH4～9、温度0～40℃范围内正常使用。需要注意的是琼脂糖凝胶与硼酸能形成配位化合物，使其结构与孔径发生改变，应避免用硼酸缓冲液（表4-19）。
表4-19 琼脂糖凝胶规格及性能
续表
4）聚丙烯酰胺凝胶：
聚丙烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺与亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，经四甲基乙二胺催化聚合而成的亲水性凝胶，如美国伯乐公司产商品名为生物凝胶-P。生物凝胶的孔径随凝胶总浓度或交联度增加而变小。其稳定性与葡聚糖凝胶相比更为稳定，在pH2～11范围内稳定，有较高分辨率和机械强度。商品生物凝胶编号能反映出其分离界限，如Bio-GelP-100，将编号乘以1000为100000，即为它的排阻极限（表4-20）。
表4-20 聚丙烯酰凝胶规格及性能
5）多孔玻璃珠：
多孔玻璃微球物理化学稳定性高，能耐受高温灭菌及较强烈的反应条件；机械强度大，能在高压下操作，流速快，试验重复性好；能抵御酶及微生物的作用，性能稳定。缺点是有大量硅羟基存在，亲水性不强，对糖类、蛋白质等物质特别是碱性蛋白质有非特异性吸附作用。常用聚乙二醇浸泡加以钝化后使用。商品名为Bio-Glas，后面的编号代表其孔径，编号越大，分离分子量越大（表4-21）。
表4-21 多孔玻璃微球的规格及性能
续表
6）疏水性凝胶：
常见的疏水性凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。适用于疏水性物质及非水溶液，以聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯含量控制孔径，但也受到洗脱剂的影响。如在芳香族溶剂中其溶胀度大，排阻极限也增大；在醇类物质中，骨架不溶胀，孔径小，排阻极限也小（表4-22）。
表4-22 疏水性凝胶规格及性能
（3）凝胶层析的应用及影响分离的主要因素：
凝胶色谱法应用范围广泛，一般在恒定的缓冲溶液下，根据物质分子量不同进行分离。选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的根本保证。
1）凝胶层析的应用：脱盐：
脱盐用的凝胶多为大颗粒、高交联度的凝胶如SephadexG-25、G-50。由于交联度大，颗粒强度高，加之凝胶颗粒大，流速快，处理量也较高。用层析柱脱盐时，上样样品的体积必须小于柱内水体积，一般小于内水体积的1/3，以便得到理想脱盐效果。
分离纯化：一般用于分子量相差较大物质的分离。一般用于精细分离时上样体积应小于柱体积的5%，最好控制在2%以内，以便达到较好的分离效果。
相对分子量测定：根据不同分子量的物质，只要在凝胶的分离范围内，其洗脱体积或分配系数与相对分子质量的对数呈线性关系。测定时先以三个以上已知分子量的标准蛋白过柱，测取各自洗脱体积并以洗脱体积为纵坐标，分子量对数作为横坐标制作标准曲线。再测定待测物质的洗脱体积，便可由标准曲线求得分子量。该法测定的分子量为近似分子量，误差在10%，对球形分子的测量精确度较高，对棒状分子的测量值小于实际值。一般准确测定分子量采用质谱分析方法。
去热原：应用于无热原水的制备及低分子生物制剂中抗原性杂质的去除。如用Sephadex G-25凝胶去除氨基酸中的热原性物质效果较好；另外，用DEAE-Sephadex-A25去除水中的热原效果较好。
2）影响分离的主要因素：
选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的关键，同时分离过程还与洗脱流速、适宜的离子强度和pH相关，还应考虑上样量、样品黏度及凝胶柱床高度。
介质选择：只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如将蛋白质脱盐，可采用排阻极限小的介质如Sephadex G-25或G-50，上样量大，洗脱流速快；分离分子量相差不大的分子，如分离蛋白质与其聚合体，可根据表中各种凝胶排阻范围加以选择，同时还需控制上样量及上样流速，才能达到较好的分辨效果。
洗脱流速：洗脱流速过快会使色谱带变形，影响分离效果。因此根据具体试验情况在凝胶线性流速范围进行选择。特别是使用分子筛时，降低流速能达到较好的分辨效果。
洗脱液的离子强度与pH：对水溶性物质的洗脱应采用适宜的离子强度与pH，酸性蛋白的洗脱很少受离子强度变化的影响；碱性蛋白在酸性条件下易于洗脱，洗脱液中应含一定浓度的无机盐；多糖物质洗脱以水最佳。
上样量：用于分级分离时，上样前需浓缩，为达到较好分离效果，上样量控制在柱体积的2%～5%。
样品黏度：样品相对于流动相的黏度越大，分辨率越差。一般要求样品的黏度小于0.01Pa·s，蛋白质类样品浓度一般要低于40mg/ml左右。
凝胶柱及填装：凝胶层析法分离蛋白一般要求有较细的柱径、较长的柱长及柱床高度，所需柱长通常为内径的25～40倍，装柱后测量柱效。如用Sephacryl S-100分离蛋白质，所需柱床高度应不小于80cm，柱效不低于9000。
2.离子交换层析
离子交换层析（ion exchange chromatography，IEC）是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的方法。该法可以同时分离多种物质，具有工作容量大、灵敏度高、重复性好、选择性强、分离速度快等优点，是当前最常用的层析方法之一，常用于蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等的分离纯化。
（1）离子交换色谱原理：
离子交换色谱原理是利用离子交换剂的荷电基团，吸附溶液中带电离子或离子化合物，这种结合是可逆的，被吸附的物质随后被带有同类型电荷的其他离子所置换，而被洗脱下来。由于不同物质对交换剂的结合力不同，在梯度洗脱过程中，被洗脱下来的顺序不同，因而达到分离的目的。离子交换现象可用下面的方程式表示：
式（4-7）中，R -代表阳离子交换剂功能基团和载体；A ＋表示平衡离子；B ＋表示交换离子。
离子交换剂的选择性可用平衡常数 K表示，即：
如果反应溶液中〔A ＋〕=〔B ＋〕，则 K=〔RB〕/〔RA〕。当 K＜1时，〔RB〕＜〔RA〕表示离子交换剂对B ＋的结合力小于A ＋；当 K=1时，〔RB〕=〔RA〕表示离子交换剂对A ＋、B ＋的结合力相同；当 K＞1时，〔RB〕＞〔RA〕表示离子交换剂对B ＋的结合力大于A ＋。 K值反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性参数。两性电解质（如蛋白质、氨基酸、核苷酸等）与离子交换剂的结合能力，主要取决于它们的理化性质与特定条件下呈现的离子状态。当pH＜p I时，蛋白质带正电荷，能被阳离子交换剂吸附；反之，当pH＞p I时，蛋白质带负电荷，能被阴离子交换剂吸附。溶液的pH偏离等电点越远，蛋白质分子所带的净电荷量越大。由于蛋白质等生物大分子等电点不同，可通过改变溶液的pH和离子强度影响它们与离子交换剂的吸附作用，从而使它们得到分离纯化。图4-6为离子交换吸附和洗脱示意图。
图4-6 离子交换吸附和洗脱示意图
（2）离子交换层析介质：
据离子交换介质材质及亲水性不同可分为亲水性的天然或合成高聚物如纤维素系、葡聚糖系、琼脂糖系等，疏水性的聚苯乙烯高聚物，耐高压的刚性有机合成高聚物，硅胶颗粒等。作为离子交换介质应具备以下条件：要有大的交换容量和良好的交换选择性；稳定性好，耐受酸碱、钙盐、有机溶剂、温度及压力环境；凝胶颗粒大小均匀，介质内孔径大小分布要均匀，并具有一定强度；交换速度快，可逆性好，易洗脱和再生，可反复使用。
常见的离子交换介质的功能基团见表4-23。
表4-23 常用离子交换介质功能基团
续表
目前已商品化的离子交换介质的品种主要有：
纤维素离子交换系列：纤维素具有松散的亲水网络、孔径大、比表面积大等优点。目前常用的珠状离子交换纤维是用高纯微晶纤维素经交联、功能基化而制备。如DEAE-Sephacel是在合成过程中破坏微晶结构经重新组合而成的珠状物，再用氯代环氧丙烷进行交联而成大孔结构。几种常用的纤维素系离子交换介质如表4-24所示。
表4-24 常用纤维素系离子交换介质
葡聚糖离子交换系列：是以SephadesG-25及SephadesG-50两种凝胶过滤介质为母体，引入离子交换功能基团后形成，具有较高的容量。名称中的A表示阴离子交换介质，C表示阳离子交换介质；功能基中WB为弱碱性，WA为弱酸性，SB为强碱性，SA为强酸性；Hb为血红蛋白。几种常用的葡聚糖系离子交换介质如表4-25所示。
表4-25 常用葡聚糖系离子交换介质
琼脂糖离子交换系列：常用的琼脂糖离子交换系列分为Bio-GelA系和Sepharose系。几种常用的葡聚糖系离子交换介质如表4-26所示。
表4-26 常用琼脂糖系离子交换介质
Mono eads离子交换系列：以亲水性聚醚为骨架，具有刚性好、粒径小、分辨效率高的优点，常用于蛋白质、肽类或低聚核苷酸分析柱的制备。几种常用的Mono eads系离子交换介质如表4-27所示。
表4-27 高效离子交换介质
（3）离子交换层析的应用及影响分离的主要因素：
离子交换层析法广泛应用于蛋白质、氨基酸、核苷酸、多糖及有机酸等生物大分子的分离纯化。目前约有80%蛋白质分离纯化中应用离子交换。一般采用盐浓度梯度洗脱，将目的蛋白与杂质分离，纯化倍数可达3～10倍。影响分离的主要因素如下：
1）介质选择：
离子交换介质分为酸性的阳离子交换介质和碱性的阴离子交换介质，按酸性或碱性强弱分为强型和弱型。如强酸型阳离子交换介质功能基团为— 
，在pH1～14范围都有吸附；弱酸型阳离子交换介质功能基团为—COOH，一般在pH5.0～10.0范围才有吸附。一般情况下，在对未知物质进行纯化工艺摸索时，采用强型离子交换介质，因其使用范围更广，但存在吸附后难以解析的，一般需要较强的条件（如用强酸或强碱）进行洗脱。因此在实际工艺设计中，根据摸索的试验条件，更多考虑弱型离子交换介质。上样量应根据选择介质的最大吸附量进行调整。
，在pH1～14范围都有吸附；弱酸型阳离子交换介质功能基团为—COOH，一般在pH5.0～10.0范围才有吸附。一般情况下，在对未知物质进行纯化工艺摸索时，采用强型离子交换介质，因其使用范围更广，但存在吸附后难以解析的，一般需要较强的条件（如用强酸或强碱）进行洗脱。因此在实际工艺设计中，根据摸索的试验条件，更多考虑弱型离子交换介质。上样量应根据选择介质的最大吸附量进行调整。
2）离子强度：
离子交换吸附应在较低的离子强度下进行，最好选择允许目的分子与离子交换介质能够结合的最高离子强度；而洗脱时应选择可使目的蛋白与介质解析的最低离子强度。目的蛋白解析后应用更高的离子强度彻底清除可能残留的牢固吸附杂质，具体离子强度应根据试验确定。一般在吸附阶段采用含0.1mol/L氯化钠的10～50mmol/L缓冲溶液中进行。在此离子强度下目的蛋白不会被洗脱下来，而样品中与离子交换剂结合不牢的杂质将会被解析下来。离子交换一般不在盐析分离后进行，必须进行时应先除盐。
3）pH：
要使目的蛋白以适当的强度结合到离子交换介质上，需选择合适的吸附pH。对于阳离子交换介质，吸附pH应至少低于目的物质等电点1个pH单位；对于阴离子交换介质，吸附pH应至少高于目的物质等电点1个pH单位。pH偏离等电点越远，净电荷越多，越易吸附，但解析困难，具体pH应由试验确定。操作过程也可以选择目的蛋白流穿、杂质被吸附的方式，如对于阳离子交换介质，溶液的pH高于等电点，使目的蛋白带负电荷而流穿，此方式不适用于纯化分离，一般用于去除样品中的热原或宿主蛋白等。
3.亲和色谱
酶、蛋白质、抗体、激素等生物物质，具有识别特定物质并与该物质的分子特异性相结合的能力。这种识别并结合能力具有排他性，即生物分子具有能够区分结构与性质非常相近的其他分子，选择性地与其中某一分子相结合。其结合方式为立体构象结合，具有空间位阻效应。结合的作用力包括静电作用、疏水作用、范德华力及氢键等。亲和色谱（affinity chromatography，AC）是利用生物分子与其配体特异性结合作用进行生物物质分离纯化的色谱技术。早在1910年，就有人利用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶。到了20世纪60年代，亲和色谱的优点得到充分认识和发展，亲和层析的名称也被首次利用。亲和色谱具有操作简单、选择性强、分离速度快、分辨率高、分离条件温和等优点，一次过柱就能得到高纯度的活性物质。但缺点是吸附剂通用性较差，分离不同物质都需制备专用配基，洗脱条件苛刻，价格昂贵及有些配基易脱落。随着新型介质的应用与各种配体的出现，使亲和色谱得到越来越广泛的应用。
（1）亲和色谱原理：
亲和色谱是在介质上键合可逆结合特异性目的分子的适当配体，含有目的分子的待分离物质通过时，与目的分子特异性结合并去除了所有未结合杂质，再以一定洗脱条件将单一目的分子洗脱下来。亲和色谱分离基本原理如下：
1）配基固定化：
选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质。
2）吸附样品：
配基与被分离生物大分子间专一性识别或特异性吸附，杂质与介质间无亲和作用而被去除。配基与生物活性物质吸附作用必须是可逆的。
3）样品解析：
选择适宜的条件使被吸附的活性物质解析。
（2）亲和色谱介质：
亲和色谱介质是利用大多数大分子物质与某些相应的分子专一性可逆结合的特性，将亲和配基通过化学键固定在色谱介质上而得到的。因此，色谱介质的制备首先要选择介质和配基，其次是介质的活化或功能化及活化的介质与亲和配基偶联。
1）介质的选择：
介质的亲和配基附着的基础和骨架，应具有如下特性：理化性质稳定，非特异性吸附小且生物惰性，不因共价偶联反应和吸附条件的变化发生改变；具有多孔立体网状结构，能使大分子自由通过，使亲和对的两种成分在自由溶液中充分相互作用；必须能够活化或功能化，且具有大量可供活化和配基结合的化学基团；具有高度亲水性，亲水性是保证被吸附物质稳定的重要因素，同时有助于达到亲和平衡并减少因疏水造成的非特异性吸附；具有大小均匀、机械强度高等性能，保证良好的流速。
常用的介质有多糖类如纤维素（celluose）、葡聚糖（dextrin）、琼脂糖（agarose）凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及无机介质等。
2）配基的选择：
配基的选择主要取决于分离对象，应具有专一性，仅识别被纯化的目的物（配体），不吸附其他杂质，可根据配体的生物学特性寻找；应有足够大的亲和力；与目的物间的结合具有可逆性，这样能够在一定条件下吸附和解析；大小选择适宜，具有较好的稳定性。
亲和配基按亲和力的大小可分为两类，一类为特殊配基，其 K eq值为10 7～10 15，如生物素、激素、抗原等；另一类为通用配基， K eq值为10 4～10 6。亲和力越高，则生产中需要的洗脱条件就越苛刻。特殊配基包括酶的抑制剂、抗体、受体等。常用的特异性亲和配基包括天然配基、染料、氨基酸或肽、核酸、肝素、螯合金属离子等。特异性亲和配基由于分子较小、容量高、成本低，因而其实用性越来越受到重视。几种常用的亲和层析介质、配基及目的产物如表4-28所示。亲和色谱中配基的选择和洗脱条件如表4-29所示。
表4-28 商品化的亲和色谱介质、配基及其目的产物
续表
表4-29 亲和色谱中配基的选择和洗脱条件
续表
3）活化与偶联：
亲和色谱的介质由于其相对惰性，往往不能直接与配基相连，偶联前一般需活化。亲和配基与色谱介质化学反应过程应相对温和，尽可能保持介质与配基的原来性能，保证专一性或特异性作用。活化的方法较多，常见的方法如表4-30所示。
表4-30 常见活化方法比较
（3）亲和色谱的应用及影响分离的主要因素：
亲和色谱法广泛应用于生物分子、各种功能细胞、细胞器、膜片段和病毒颗粒的分离纯化，生化成分的分离检测及其他分离手段难以分离的大分子物质，尤其对分离某些不稳定的大分子物质更具优越性。亲和色谱分离纯化应考虑以下几个方面：
1）吸附条件的选择：
吸附条件最好是自然状态下配体与目的分子间反应的最佳条件，如缓冲盐的种类、浓度及pH等条件。如金黄葡萄球菌蛋白A和免疫球蛋白IgG间的结合主要是疏水作用，可以通过增大盐浓度、调节pH来增强吸附。对配体与配基结合情况不了解，就必须对盐种类、浓度及pH等条件进行摸索。此外应考虑流速对吸附的影响，流速不能太快，应调节至能够充分吸附，延长吸附时间，可以在上样后静置一段时间再进行洗脱。上样量可根据填料的吸附容量来推算，通常为吸附容量的1/3或更低，对于吸附力弱的物质，上样量按照1/10为佳。在样品上柱后，使用10倍柱体积的缓冲溶液将不结合的杂质清洗掉。
2）吸附后清洗条件的选择：
某些杂质可以非特异性地吸附，为获得高纯度的目的分子，应选择一定强度的清洗缓冲液，其强度应介于目的分子吸附条件与目的分子洗脱条件之间。如碱性成纤维细胞生长因子在含0.6mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液中吸附，洗脱条件为含2.0mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液，则考虑使用1.2mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液进行杂质清洗。
3）洗脱条件的选择：
从柱中洗脱目标产物是亲和色谱是否成功的关键。通常采用降低目标产物与配体之间的亲和力的方式进行洗脱。可用一步法或连续改变洗脱剂浓度的方式将目标产品洗脱下来。改变pH和离子强度也能改变配体与蛋白质间的作用力，洗脱目标产品。洗脱过程的选择应考虑目的分子的耐受性，对于吸附得十分牢固的生物大分子，必须使用较强的酸或碱作为洗脱剂或在洗脱液中加入破坏蛋白质的试剂，如脲、盐酸胍。这种洗脱方式往往造成不可逆的变化，使纯化的对象失去生物学活性。因此，对于洗脱得到的蛋白质溶液应立即进行中和、稀释或透析。
4.疏水性相互作用色谱
疏水性相互作用色谱（hydrophobic interaction chromatography，HIC）是根据生物分子疏水性差异进行相互分离的色谱技术。疏水色谱最早研究是J.Porath研究的疏水吸附中的盐析效应，1973年Hofstee和Shaltiei分别提出了疏水色谱的概念。主要应用于蛋白质、氨基酸或多肽等生物分子色谱分离。
（1）疏水性相互作用色谱原理：
疏水性相互作用色谱原理是利用蛋白质类生物大分子上的疏水基团或区域在疏水作用体系中，与介质上的疏水基团相互作用，达到吸附平衡，然后根据不同分子吸附强弱差别，在一定条件下解析达到分离目的。亲水性蛋白质表面上均含有一定量的疏水基团，疏水性氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸等）含量较多的蛋白质疏水性基团多，疏水性强。在蛋白质水溶液中，暴露于蛋白质表面的疏水基团或疏水部位与亲水性固定相表面的弱疏水基团相互作用，被固定相吸附。蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随离子强度的提高而增强。因此疏水色谱与离子交换色谱不同，在高盐下进行吸附，解析则采用降低流动相离子强度的线性梯度洗脱或逐次洗脱法。
（2）疏水性相互作用色谱介质：
适宜制备疏水作用的层析介质材料很多，应用最广的是琼脂糖。常用的疏水性配基有苯基、短链烷基（C 3～C 8）、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。疏水性吸附作用与配基的疏水性（疏水链长度）和配基密度成正比，故配基修饰密度应根据配基的疏水性而异，疏水性高的配基较疏水性低的配基修饰密度低。配基修饰密度过小疏水性吸附作用不足，密度过大解析困难。一般来说可以用低碳数的配基可以进行吸附，不必用高碳数疏水配基。一般配基修饰密度在10～40μmol/ml之间（表4-31）。
表4-31 常见的疏水性吸附剂
续表
（3）疏水性相互作用色谱的应用及影响分离的主要因素：
疏水性相互作用色谱没有离子交换色谱应用广泛，作为离子交换色谱补充工具，主要应用于蛋白质、氨基酸或多肽等生物分子盐析或离子交换后的色谱分离。疏水性相互作用色谱分离纯化应考虑以下几个方面：生物分子的疏水性与其荷电性质相比复杂得多，不易定量掌握，与介质功能基的种类、流动相中盐的种类和浓度、操作温度及pH、添加剂等因素相关。
1）介质选择：
疏水性强的生物分子应选择较弱的疏水基团，否则结合过于牢固不利于解析；反之，疏水性弱的生物分子应选择较强的疏水基团，否则无法结合或结合力较弱，影响分离效果。一般试验时，先用低疏水性的介质，选择在低盐浓度下得到最高分辨率和载量的介质。
2）离子强度与种类：
离子强度高，有利于蛋白吸附，吸附容量大。盐种类也对疏水色谱有影响，盐析效果越显著的盐，对疏水作用影响越大。Hofmeisteer给出著名盐析效应离子串（图4-7）。一般硫酸铵的浓度在1～2mol/L，氯化钠在2～4mol/L，根据不同生物分子通过试验找出载量最大、分离效果最好的浓度。
图4-7 Hofmeisteer离子串
3）操作温度及pH：
一般吸附为放热过程，但疏水吸附相反，吸附结合力随温度升高而增大。pH对疏水色谱的影响比较复杂，流动相的pH必须在蛋白质不失活的范围。
4）添加剂：
低浓度的添加剂如水溶性醇（乙二醇等）、表面活性剂（Tween-20、TritonX-100等），可降低生物分子与配基间的疏水作用力。所以往往加入这些添加剂达到解析目的，但有些添加剂很难用常规方法去除，有时会导致介质载量下降。
5.扩张床吸附技术
扩张床吸附（expanded bed adsorption，EBA）是指20世纪90年代发展起来的新型蛋白质吸附分离技术。众所周知，在生物工程中降低分离和纯化的费用，常常是实现工业化的关键。
大规模的离子交换、疏水等固定床吸附技术要求原料中不能含有不溶性颗粒，否则会造成柱床堵塞，影响生产操作。因此，通常分离和纯化是由一系列的单元操作组成。其中首先为固液分离操作，去除溶液中的不溶性颗粒，常用离心和超滤方法，接着用层析法进行浓缩和初步纯化。当细胞尺寸较小或含细胞碎片时用传统的过滤或离心很难除去，且费用昂贵。由于发酵液或培养液的体积大、黏度高，故处理难、费时多，常引起目标蛋白质受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被破坏，故第一步操作常常成为整个下游过程的制约步骤。为简化生化分离步骤，提高纯化效率和活性回收率，国内外一些学者提出了过程集成的概念，即在一个操作中完成常规分离几个单元操作完成的任务。基于这种思想，产生了一批集成化的分离纯化技术，如亲和萃取和亲和沉淀、亲和膜吸附等。英国剑桥大学的H.A.Chase等在研究流化床吸附的基础上，发展了能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附（EBA）技术。应用该技术可直接从细胞破碎液中提取出较纯的目标产物，固液分离和吸附同时进行，相当于合并了除细胞碎片和初步纯化。EBA集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。该技术的问世立即引起其他学者的重视，短短几年EBA技术的应用研究迅速发展，很多学者都证明，EBA技术是一种可以直接从含颗粒料液中提取生物大分子的新技术。
（1）扩张床的吸附原理：
扩张床是流化床的一种特殊形式，兼有了固定床与流化床的优点，同时又克服了两者的缺点。较之于流化床的快流速、高返混，扩张床的返混程度很低，操作接近于固定床。在扩张床中床层高度随液相流速线性增大。当从底部泵入缓冲溶液达到最低流化流速 U mf时，柱床开始扩张，吸附剂间隙增大，有利于悬浮颗粒通过，直至缓冲溶液流速达到吸附剂的终端流速 U t即缓冲溶液流速与吸附剂颗粒沉降速度达到平衡，便形成了稳定的扩张床。因此流速应选择在 U mf＜ U＜ U t范围。扩张床层扩张规律符合Richardson-Zaki方程，即：
式（4-9）中， U为液相空塔速率；ε为床层空隙率； n为Richardson-Zaki系数（层流区 n值一般为4.8）。
吸附剂的终端流速（ U t）可用Stokes沉降方程计算，即：
式（4-10）中， U t为吸附剂的终端流速； d p为颗粒直径；ρ s为固体密度；ρ L为液体密度；μ L为黏度。
由方程可知，液相黏度和密度越大，终端流速越小，达到一定膨胀率所需要的液相流速越低。
（2）扩张床组成及吸附介质 1）扩张床的组成：
扩张床和常用的液固吸附装置一样，吸附剂外还需恒流泵、装有吸附介质的柱子和在线检测装置或收集器。吸附柱底层液体分布器非常重要，它应保证床截面的流速分布均匀，透过料液内的微粒子而截流吸附剂。扩张床床层上部安装有可调节床层高度的调节器，它的位置能自由改变，吸附操作过程中需恰好在膨胀床层的顶部，以减小吸附死体积。
2）吸附剂：
适用于扩张床的吸附剂需要有一定粒径和密度分布外，还应满足以下条件：尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需去除的颗粒间有明显差异；应具有良好的孔道结构，不易被料液中脂类、核酸和杂蛋白等生物物质污染；应具有活性基团，可以修饰吸附目的产物的配基，并对目的产物有较高吸附容量；具有较高化学稳定性和良好机械强度，可进行在线清洗（CIP），使用寿命长；具有良好传质性能，在较高流速下，保持较高吸附量。
可形成稳定膨胀床的吸附剂主要有两类。一类是磁性粒子，在外部磁场作用下，磁性粒子呈现稳定的流化状态，但缺点是设备复杂，反复清洗过程中磁性粒子稳定性差。另一类是具有一定粒径和密度分布，在液体流速的分级作用下，大粒径或高密度吸附剂分布于床层底部附近，而小粒径或低密度吸附剂分布于床层顶部，在床层内形成稳定的吸附剂粒径或密度分布，使液相和固相返混较小。如Pharmacia公司开发的高密度吸附剂多孔玻璃和STREAMLINE（交联琼脂糖凝胶内包埋晶体石英，以提高吸附剂密度）等。
（3）扩张床色谱的应用及影响分离的主要因素：
扩张床色谱主要用于抗体、蛋白质等生物大分子的过滤、浓缩和初步分离。其操作与其他固定床吸附流程相似。扩张床技术目前还处于实验室或中试阶段，大规模生产的例子很少。
影响分离的因素包括柱床扩张特性及稳定性，原料液成分及黏度，流洗、洗脱及再生条件控制等。
1）柱床扩张特性及稳定性：
柱床扩张特性指柱床对流速变化的反应特性，它主要受介质粒径、介质颗粒与原料液间的密度差及原料液的黏稠度影响。介质粒径越大，密度越高，达到相同扩张程度所需流速越高。原料液密度越大，黏稠度越高，单位流速变化引起扩张床变化也越大。柱床扩张达到平衡后应对扩张床稳定性进行评估。主要评估方法有目测法、柱床扩张的测定及理论塔板数测定。只有稳定的扩张床才能获得较高的吸附效率和纯化效果。一般扩张床扩张为2～3倍沉降床高度，理论塔板数与预期相差不小于20%为宜。
2）原料液成分及黏度：
原料液的成分十分复杂，一些大颗粒（如核酸、多糖、细胞团块等）会污染介质，堵塞造成扩张床不稳定，影响柱效，还可影响介质的载量和选择性。黏度过高对扩张床稳定性产生负面影响，一般控制原料液中生物性物质干重比例在8%以下为宜。
3）流洗：
流洗步骤中，应将溶解的和不溶性颗粒彻底从柱床洗出，以保证进一步精细纯化。一般需要流洗5个沉降柱床体积以上，流洗溶液中可加25%甘油将细胞和未吸附的蛋白质洗出。
4）洗脱：
洗脱应在柱床沉降状态下以固定床方式进行。根据介质载量情况选择洗脱方向，吸附的目的分子较少时一般正相洗脱，载量饱和一般反相洗脱。可用分步洗脱法或梯度洗脱法，也可按扩张床模式进行洗脱。
5）再生：
每次洗脱完毕后必须在线清洗，延长扩张床使用寿命。大多数再生操作都使用0.5～1.0mol/L NaOH清洗3～4小时，再用30%异丙醇或20%～70%乙醇洗涤，再生以后应校验动态吸附容量和床层的扩展程度，变化不能太大。对于不能耐受NaOH清洗介质，可改用8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍或1mol/L醋酸进行清洗。
（田海山）