人类ABO血型系统包括四种主要的表现型: A、B、O和AB。ABO血型由红细胞上A和B抗原的有或无决定，ABO系统还以血清中存在自然发生的规则抗体为特点，即血清中含有针对自身红细胞所缺的A或B抗原产生的同种凝集素(也称为“天然抗体”)。人类红细胞上A和B抗原的有或无与血浆中抗A和抗B抗体的产生存在着相反的互补关系。例如O型个体红细胞上缺少A和B抗原，其血清中含有抗A和抗B抗体。

利用红细胞凝集试验，通过正反定型可准确鉴定ABO血型。所谓正定型，也称为红细胞定型试验，是指用标准抗A和抗B试剂来测定红细胞上的A抗原和B抗原;所谓反定型，也称为血清定型试验，是指用标准A型细胞和B型细胞来测定血清中有无相应的抗A和抗B抗体。“天然抗体”的免疫原可能是肠道及环境中的细菌，例如在大肠埃希菌的脂多糖外壳中含有ABO类似结构。

试管法是ABO定型试验的经典方法。

抗凝或者不抗凝的样本均可用于ABO鉴定试验。红细胞可以悬浮在自身血清、血浆或盐水中，也可以洗涤后悬浮于盐水中。通常情况下，试管法正定型被检样本与反定型中试剂红细胞的细胞悬液浓度皆为2%～5%。

( 1)抗A血清。

( 2)抗B血清。

( 3) 2%～5%的A ₁型，B型红细胞盐水悬液。

( 4)如果需要，可增加抗A，B试剂和A ₂血型红细胞。

检测红细胞上的A或B抗原。①加1滴抗A到一支洁净试管中并标记;②加1滴抗B到一支洁净试管中并标记;③如果需要，可选做加1滴抗A，B在第三支试管，并标记;④向每一试管滴加1滴2%～5%的待检红细胞悬液;⑤轻轻混匀，按照校准速度和时间离心，通常( 900～1000)×g离心15秒;⑥轻轻重悬细胞扣，检查凝集情况;⑦观察、解释、记录试验结果，并与血清(血浆)试验结果对照。

检测血清或血浆中的抗体。①取2支洁净试管，分别标记A ₁和B，分别向其中滴加2～3滴血清或血浆;②加1滴A ₁型试剂红细胞到标记A ₁的试管;③加1滴B型试剂红细胞到标记B的试管;④如果需要，加1滴A ₂试剂红细胞到一支已加入2～3滴血清或血浆的试管中，并做好标记;⑤轻轻混合试管内容物，按照校准速度和时间离心，通常( 900～1000)×g离心15秒;⑥检查是否有溶血现象。然后轻轻重悬细胞扣，检查凝集情况;⑦观察、解释、记录试验结果，并与红细胞试验结果对照。

( 1)细胞试验中的凝集以及血清或血浆试验中的溶血或凝集均为阳性结果。

( 2)细胞扣重悬后表现为均匀的细胞悬液是阴性结果。

( 3)凝集强度判断标准参见表1-5-1。

( 4) ABO定型的血清或血浆试验以及红细胞试验的解释见表1-5-2。

( 5)如果红细胞定型试验与血清定型试验结果不一致，应通过进一步试验解决，然后才给出ABO血型结果。

( 6)混合视野凝集的情况，应进一步找出原因:例如是否混合血样标本，近期有无输血史，是否白血病急性期或者ABO亚型等。

( 7)按表1-5-2报告受检者红细胞ABO血型。

( 1)红细胞试验中抗体试剂与待测红细胞产生3 +～4 +的凝集为阳性反应。血清与试剂红细胞的反应经常较弱。血清试验可以在室温孵育5～15分钟以增强弱凝集反应，观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度，有助于弱凝集的发现。

( 2)试管法定型反应快，需时短，特别是紧急输血时，可立即离心观察结果;通过离心增强凝集，可发现亚型和较弱的抗原-抗体反应，结果准确可靠，是ABO定型的常规方法。

用玻片法进行ABO正定型时，待检红细胞悬液的浓度是10%～15%。玻片法一般只能做正定型。

( 1)抗A。

( 2)抗B。

( 1)加1滴抗A到一洁净的玻璃片或白瓷板凹孔中，并做好标记。

( 2)加1滴抗B到一洁净的玻璃片或白瓷板凹孔中，并做好标记。

( 3)向以上玻片上或白瓷板凹孔中的每一种试剂中分别加1滴充分混匀的待检红细胞悬液。

( 4)充分混合抗体试剂和细胞，用搅拌棒将混合物均匀分散。

( 5)不断地从一边到另一边轻轻倾斜转动玻片或白瓷板，持续大概2分钟。在此期间不要将玻片或瓷板放在热的表面上。

( 6)读取，解释并记录所有玻片或白瓷板凹孔中的结果。

( 1)任何ABO定型试剂与红细胞反应表现强凝集都是阳性结果。

( 2)在反应2分钟末红细胞仍呈现均匀悬液是阴性结果。

( 3)弱阳性或可疑结果应使用试管法进一步确认。

( 1)玻片法可能存在感染性标本暴露的风险，需注意防范。

( 2)玻片法可作为ABO血型初筛或复检。

( 3)玻片法定型简单，不需离心设备，适合大规模血型普查，但该法反应时间较长，不适合急诊定型。

( 4)玻片法不适合检测血清或血浆中的抗体，故不适用于抗体鉴定和交叉配血。

( 5)玻片法不适合检测ABO亚型。亚型红细胞抗原与抗体的凝集反应慢、凝集强度弱，可能导致定型有误。

( 6)我国输血技术操作规程要求玻片法正反定型均做，而美国血库协会( AABB)操作手册中玻片法仅用于正定型。

同玻片法和试管法。

( 1) ABO试剂红细胞。

( 2)柱凝集血型卡。

( 1)配制好检测样本的红细胞悬液和试剂红细胞悬液。通常用于柱凝集试验的红细胞悬液浓度比试管法低，比如可选用1%或0.8%的红细胞盐水悬液50μl，个别新生儿卡中选用5%的红细胞盐水悬液10μl。

( 2)在正定型的柱凝集检测管中分别加入样本的红细胞悬液。

( 3)在反定型的柱凝集检测管中先加入反定型红细胞悬液再加入检测样本的血清或血浆。

( 4)在专用柱凝集离心机中离心。

( 5)判读并记录凝集反应结果。

根据红细胞在凝胶柱内的反应情况解释凝集强度。出现凝集和(或)溶血结果为阳性，不凝集为阴性。柱凝集法凝集强度判读表见图1-5-1、表1-5-3。

微柱凝集试验技术是较新的血型血清学检测技术，具有易于操作标准化、自动化、判读客观和可靠、结果可长期保存、有利于大量样本操作等优点，但在检测过程中，红细胞悬液中如有颗粒物质，或血样本的血浆中存在冷抗体或蛋白异常，都会干扰检测结果的判读。柱凝集血型卡法有可能难于鉴别或漏检某些ABO亚型抗原。

微孔板技术可用来检测红细胞上的抗原和血清中的抗体。一块微孔板相当于96根“短”试管，因此，其检测原理与试管法相同。

微孔板可以是硬的，也可以是软的，其底部是U形或V形的。U形底微孔板使用更为广泛，因为使用这种微孔板，可以在离心后重悬红细胞观察结果，或者将微孔板以一定角度安置，在红细胞流动模式下观察结果。两种判读方法都可以估计凝集强度。

同玻片法和试管法。

将等量液体分配到微孔板中的自动仪器。

自动光度仪，通过分析U形底孔中的吸光度，判定阳性和阴性结果。仪器的微处理器会显示血型检测的结果。必须根据生产厂商的说明，准备血清、血浆或者细胞样本。

需要购买用于常规台式离心机的特种平板载体。要建立合适的离心条件。根据生产厂商的说明，推荐使用下列离心时间和离心力。①对于柔软的U形微孔板:红细胞检测、血浆和血清检测均为700×g，5秒;②对于硬U形微孔板:红细胞检测、血浆和血清检测均为400×g，30秒。

( 1)抗A。

( 2)抗B。

( 3) 2%～5%的A ₁型，B型红细胞盐水悬液。

( 4)如果需要，可增加抗A，B试剂和A ₂血型红细胞。

①在干净U形微孔板的两孔中分别加入1滴抗A和1滴抗B，如果需要，在第3孔中加入抗A，B;②在含有血型检测试剂的孔中，分别加入1滴2%～5%红细胞生理盐水悬液;③温和地轻拍微孔板壁，混匀红细胞和试剂;④用合适的条件离心微孔板;⑤轻拍微孔板，或者使用机械摇板器，或者将板放置一定角度，使液体流动，以重悬红细胞;⑥判读，解释，记录结果。将结果和血浆或血清结果进行比较。

①在每孔中加入1滴待测血浆或血清;②在U形微孔板含有血浆或血清的每孔中分别加入1滴2%～5% A ₁和B型试剂红细胞悬液。如果选择检测A ₂，将A ₂红细胞加到第3孔内;③温和地轻拍微孔板壁，混匀各组分;④用合适的条件离心微孔板;⑤轻拍微孔板，或者使用机械摇板器，或者将板放置一定角度，使液体流动，以重悬红细胞;⑥判读，解释，记录结果。将结果和红细胞结果进行比较。

( 1)红细胞定型试验中的凝集，血浆或血清定型试验中的溶血或凝集，均被判定为阳性结果。

( 2)红细胞重悬后表现为均匀的细胞悬液是阴性结果。

( 3)对ABO检测的结果说明见表1-5-2。

( 4)细胞试验和血浆或血清试验的结果如果出现矛盾，在记录患者或献血者的ABO血型前，必须解决这个问题。

为加强弱的血浆或血清的反应，微孔板可以在室温孵育5～10分钟，然后重复离心、判读、记录的过程。

ABO血型系统中除了A型、B型、AB型和O型四种主要的表现型以外，人群中还有一部分A和B血型的变异型，称为ABO亚型。如A亚型有A ₂、A ₃、A _x、A _m、A _el等，而B亚型有B ₃、B _x、B _m和B _el等。ABO亚型受控于稀有的ABO等位基因，在人群中的频率很低，通常在几千分之一到几万分之一。

ABO亚型在常规的ABO定型试验中常常表现为正反定型结果不一致。共同特点是红细胞上的A或B抗原数量减少，正定型中红细胞与抗A，抗B试剂的反应与正常A或B型红细胞相比显著减弱，有些甚至不凝集，ABO亚型红细胞上的H抗原表达常常增强。某些ABO亚型血清中除了ABO天然抗体之外，还会产生抗A ₁(或抗B)。由于ABO亚型种类很多，不同ABO亚型常呈现独特的正反定型结果。

ABO亚型呈现独特的正反定型结果，比如A ₃或B ₃红细胞与抗A或抗B试剂表现混合视野凝集反应; A ₂红细胞与抗A试剂凝集较强，但不与抗A ₁试剂反应，因此抗A ₁试剂可以用来鉴定A ₂红细胞;与抗A相比，抗A，B常常与A _x红细胞呈增强的凝集反应等。每一种亚型红细胞上的抗原与血清中的抗体在ABO正反定型试验中表现各不相同，尚无特定的抗血清可以将它们简单地加以区分。表1-5-4所显示的是不同ABO亚型正反定型特点。B亚型的命名和血清学特点常常与A亚型相对应，但B亚型在人群中的数量和种类比A亚型少。A ₂是相对常见并且比较重要的一种A亚型，但是目前为止尚未发现与A ₂亚型血清学上相对应的B ₂亚型。

正定型属于细胞抗原定型，反定型属于血清抗体定型。ABO血型鉴定必须正反定型都做，相互印证。如果ABO正反定型结果不符，需要找到造成不一致的原因，疾病、亚型、不规则抗体、冷抗体以及自身抗体干扰是ABO正反定型不一致的主要原因。

既可能是技术性问题也可能是红细胞和血清本身的问题，常见有以下几种原因。

效价太低、亲和力不强。如抗A血清效价不高，可将A亚型误定为O型，AB型误定为B型。

过浓或过淡，抗原-抗体比例不适当，使反应不明显，误判为阴性反应。

红细胞上抗原位点过少(如ABO亚型)或抗原性减弱(见于白血病或恶性肿瘤)以及类B等。

血清中蛋白浓度紊乱(如高球蛋白血症)，或实验时温度过高，常引起红细胞呈缗钱状排列;或受检者血清中缺乏应有的抗A和(或)抗B抗体，如丙种球蛋白缺乏症;或血清中有ABO血型以外的抗体，如自身抗I或其他不规则抗体，常引起干扰;或老年人血清中ABO抗体水平有所下降。

各种原因引起的红细胞溶解，误判为不凝集。

由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集;新生儿ABO抗原尚未发育完全等。

ABO亚型在常规的ABO定型试验中常常表现为正反定型结果不一致。

正反定型结果不符时，应重复试验并分析可能的原因，首先应当排除技术性原因造成的正反定型不符。当怀疑正反定型不符是由于ABO亚型所致时，可增加必要的试验内容，例如正定型补充红细胞与抗A ₁，抗H，抗A，B试剂的反应，反定型增加血清与A ₂红细胞的反应。必要时可通过吸收放散试验检测红细胞上的弱A和弱B抗原，还可以通过检测唾液中的血型物质帮助推测ABO亚型(见本章第四节)。

严格执行操作规程，使用质量合格的试剂，细心观察和解释试验结果，重新做试验1次。对一些疑难问题必须及时请示上级主管，并进一步检查。

1)初步检查步骤:①重新从受检者采取1份新鲜血液标本，这样可以纠正因污染或搞错样本造成的不符合。②将红细胞洗涤1～3次，配成5%的盐水细胞悬液，用抗A、抗B、抗A ₁、抗A，B及抗H做试验可以得到其他有用的信息。③对待检红细胞做直接抗球蛋白试验，如结果呈阳性，表示红细胞已被抗体致敏;用A ₁、A ₂、B、O红细胞及自身红细胞检查待检血清。如果怀疑是抗I，用O型(或ABO相合的)脐血红细胞检查。④如果试验结果未见凝集，应将细胞及血清试验至少在室温和4℃放置30分钟，用显微镜检查核实。⑤如疑为A抗原或B抗原减弱，则可将受检红细胞与抗A或抗B血清作吸收及放散试验，以及受检者唾液作A、B、H血型物质测定。人群中大约80%的个体属于ABH分泌型，可以通过其唾液检测血型物质的种类;如试验结果红细胞呈缗钱状排列，加生理盐水1滴混匀，往往可使缗钱现象消失。应注意不应先加盐水于受检者血清中，再加试剂红细胞作试验，以免使血清中抗体被稀释。⑥如受检者为A型血而疑为有类B抗原时，可用下列方法进行鉴别: a.观察细胞与抗A及抗B的凝集强度，与抗A的反应要比与抗B的反应强，这种区别用玻片法作试验更为明显; b.用受检者红细胞与自身血清作试验，血清中的抗B不凝集自身红细胞上的类B抗原; c.检查唾液中是否有A、B物质，如果是分泌型，可检出A物质或(和) B物质; d.核对患者的诊断。类B抗原的形成与结肠癌、直肠癌、革兰阴性杆菌感染有关。⑦如发现多凝集现象，应考虑由遗传产生的Cad抗原活性、被细菌酶激活的T或TK受体、或产生机制不太明了的Tn受体所引起。多凝集红细胞具有以下特点: a.能被人和许多家兔的血清凝集; b.能与大多数成年人的血清凝集，不管有无相应的同种抗体; c.不被脐带血清凝集; d.通常不与自身的血清凝集; e.如有条件可用外源凝集素加以鉴别。

2) A、B反定型红细胞悬液的制备:①分别采取已知A、B血型的红细胞，经盐水洗涤3次，以压紧红细胞配成不同浓度的红细胞悬液(表1-5-5) ;②为了防止红细胞悬液敏感性不一致，可随机采取3个或3个以上同型的健康成人血液，按A、B型分别混合后，按上法制备;③如条件许可，可分别制备A ₁、A ₂及其他亚型的红细胞悬液，以供ABO亚型鉴定时参考;④如欲将红细胞保存，应严格注意无菌技术采集血液，以ACD保存液按4∶1抗凝，置4℃冰箱可保存3周。临用时取出一部分经盐水洗涤后配制成所需的浓度。如以红细胞保存液保存，在4℃下可保存4～5周。红细胞保存液的配法: 5.4%葡萄糖液640ml及109mmol/L枸橼酸钠264ml混合后，加新配的1%硫柳汞液1.8ml，经高压灭菌的( 110℃，15分钟)溶液最后pH为7.4，使用时压积红细胞与保存液的容积比为6∶1。

一些ABO亚型的抗原非常弱，以至于直接凝集试验检测不到，甚至在降低孵育温度和增强抗体强度后仍检测不到这些弱抗原。可先用抗A或抗B吸附于红细胞上的A抗原或(和) B抗原，然后将结合的抗体放散下来，放散液通过与试剂A ₁和B红细胞的反应，来评价放散液中是否有抗A或抗B抗体。对于正定型单克隆抗A，抗B及人源抗A，抗B均无法检出抗原，且反定型检出相应抗体的标本，需要进行吸收放散试验。

待检红细胞。

人源性抗A和(或)抗B试剂。由于某些单克隆ABO定型试剂对pH和渗透压的改变较为敏感，这些试剂可能不适合用于吸收和放散试验。

1.放散试剂　见本章第四节。

2.3份不同个体的O型红细胞。

3.3份不同个体的A ₁或B型红细胞

1.用生理盐水洗涤1ml待测红细胞至少3遍，最后一遍吸弃所有上清。

2.加1ml抗A试剂(如果怀疑A亚型)或1ml 抗B试剂(如果怀疑B亚型)到洗涤好的压积红细胞。

3.混匀红细胞和抗体，置4℃孵育1小时，这期间可偶尔混匀一下。

4.离心混合物，移除所有上清试剂。

5.将细胞转移到一个洁净的新试管中。

6.用大量(至少10ml)冷盐水( 4℃)至少洗涤8遍。保留末次洗涤上清分装到新的试管中，与放散液做平行试验。

7.选用一种适合的放散方法(如热放散)重获ABO抗体(参见本章第四节)。

8.检测放散液和(第6步中获得的)末次洗涤液，分别与3个O细胞以及3个A ₁或B红细胞反应(根据吸收所用抗体选择合适的A ₁或B细胞)。向两组试管中分别加2滴放散液和洗涤液，然后向试管中加上述红细胞悬液1滴，立即离心检查凝集。

9.如果离心后没有观察到凝集，室温孵育15～30分钟。

10.如果室温孵育后仍没有凝集，37℃孵育15～30分钟，做间接抗球蛋白试验。

1.放散液中出现抗A或抗B，说明待测红细胞上有A或B抗原。只有符合以下情况，试验结果才是有效的:①任何阶段，放散液与所有3个抗原阳性的红细胞反应;②放散液与所有3个O型细胞不反应;③末次洗涤液与所有6个细胞均不发生反应。

2.放散液与抗原阳性的红细胞不反应表明待测红细胞上不表达A或B抗原。不反应也可能是没有正确做好吸收放散试验。

3.放散液与某些或全部抗原阳性细胞以及O细胞反应，说明试验过程中保留了一些额外的抗体。

4.如果末次洗涤液与抗原阳性细胞反应，试验是无效的。放散试验前，未结合的试剂抗体没有洗涤干净。

5. A ₁，B或O细胞或所有3种细胞可以平行进行吸收放散试验，作为该实验的阳性或阴性对照。