第八章　临床输血检验技术

第一节　血型检验技术

一、ABO血型检测

（一）常规ABO血型检测方法

ABO血型鉴定（ABO blood typing）包括正反定型两部分。正定型是指用标准抗-A和抗-B分型血清来测定红细胞上有无相应的A型抗原或/和B抗原。反定型是指用标准A型细胞和B型细胞来测定血清中有无相应的抗-A和/或抗-B。

【检验方法学】

1.试管直接离心法

（1）原理：

利用血凝反应原理，IgM型抗-A和抗B抗体和有A/B抗原的红细胞在液体介质中直接反应，并通过离心力加速反应，出现肉眼可见的凝集。

（2）器材：

离心机，12mm×75mm小试管，滴管，显微镜。

（3）试剂：

生理盐水，单克隆抗-A、抗-B和抗-A，B试剂血清（抗-A，B为可选），标准反定型ABO试剂红细胞。

（4）操作：

①正定型：分别滴加抗-A、抗-B和抗-A，B各1滴于标记的试管，再用滴管分别加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴，混匀。②反定型：另取试管3支，分别标明A、B和O红细胞，用滴管分别在试管中滴加受检者血清2滴，再分别加入A、B和O型试剂红细胞悬液1滴，混匀。③室温反应平衡后，以900～1 000g，离心15～30秒。轻轻摇动试管，用液体冲刷红细胞扣，肉眼观察细胞扣滑落情况，判断有无凝集或溶血现象。④结果判读与记录：凝集强度判读见表8-1，ABO血型结果判读见表8-2。

2.玻片法

（1）原理：

利用血凝反应原理，IgM型抗-A和抗-B抗体和有A/B抗原的红细胞在液体介质中直接反应，通过抗体的力量凝集红细胞而无离心力加速反应，出现肉眼可见的凝集。

（2）器材：

玻片，竹签。

（3）试剂：

同试管直接离心法。

（4）操作：

①正定型：分别滴加1滴抗-A、抗-B和抗-A，B于清洁的玻片上，再各加受检者红细胞悬液1滴（浓度参照抗血清试剂说明书），混匀。②反定型：另取洁净玻片1张，用蜡笔划成方格，标明A细胞、B细胞和O细胞，用滴管各加受检者血清1滴，再分别用滴管加A、B和O型试剂红细胞悬液1滴。③结果判读与记录：2分钟末观察结果，凝集（或溶血）为阳性反应，均匀细胞悬液为阴性结果。ABO血型结果判读见表8-2。

3.微量板法

（1）原理：

同试管直接离心法。

（2）器材：

离心机，微量板（96孔U形底或V形底微量板均可，U形底微量板更为常用）、血液分配机（可选）、平板振荡器（可选）、读板机（可选），微量加液器。

（3）试剂：

同试管直接离心法。

（4）操作：

①正定型：在U形底微量板干净的小孔内滴加抗-A、抗-B和抗-A，B各1滴，再滴加受检者2%～5%红细胞悬液（可用生理盐水、原血清或血浆悬浮）1滴。②反定型：在U形底微量板干净的小孔内各分别滴加受检者血清1滴，再分别滴加反定型ABO红细胞悬液1滴。③轻拍微量板侧面，混匀小孔内容物，以合适速度离心后，使用平板振荡器或手动轻拍微量板，使细胞扣悬起观察凝集。④结果判读与记录：红细胞出现凝集和/或溶血为阳性；红细胞均匀悬浮为阴性。ABO血型结果判读见表8-2。

4.微柱凝胶血型卡法

（1）原理：

在微柱凝胶介质中，红细胞A/B抗原与相应抗-A、抗-B抗体结合，利用凝胶的空间位阻，经低速离心，凝集的红细胞悬浮在凝胶上层，而未和抗体结合的红细胞则沉于凝胶底部。

（2）器材：

专用微柱凝胶离心机，微量加液器。

（3）试剂：

生理盐水，标准反定型ABO试剂红细胞，微柱凝胶血型卡。

（4）操作：

①按试剂说明配制好检测样本的红细胞悬液和试剂红细胞悬液。②按试剂说明在反定型的微柱凝胶检测管中先加入试剂红细胞悬液再加入检测样本的血清或血浆，在正定型的微柱凝胶检测管中加入样本的红细胞悬液。③按试剂说明在专用微柱凝胶离心机中离心。④结果判读与记录出现凝集和/或溶血结果为阳性，不凝集为阴性。微柱凝胶法凝集强度判读见表8-3。ABO血型结果判读见表8-2。

【方法学评价】

试管法定型反应快，需时短，特别是紧急输血时可在抗原抗体反应1分钟后离心观察结果；通过离心增强凝集，可发现亚型和较弱的抗原抗体反应，结果准确可靠，是定型的常规方法。

玻片法定型简单，不需离心设备，适于大规模血型普查。该法反应时间较长，不适于急诊定型；此外亚型红细胞抗原与抗体的凝集反应慢、凝集强度弱，有时容易被忽略而导致定型有误。我国输血技术操作规程中玻片法正反定型均做，而美国血库协会（AABB）操作手册中玻片法仅用于正定型。该法亦不适用于抗体鉴定和交叉配血。

微柱凝集试验技术是较新的血型血清学检测技术，具有易于操作标准化、自动化、判读客观和可靠、结果可长期保存、有利于大量样本操作等优点。但在检测过程中，如果红细胞悬液中有颗粒物质，或血样本的血浆中存在冷抗体，蛋白异常，都会干扰检测结果的判读。微柱凝胶血型卡法有可能难以鉴别或漏检某些ABO亚型抗原。

【质量保证】

1.检测前

①由于血液具有潜在生物危害性，操作前应穿好隔离服并戴好手套和口罩；试验中应做好阴阳对照。很多试验都是基于试管法的操作，观察结果时应轻轻摇动试管，不可用力振摇。②血清应充分析出后再进行操作，否则后继出现的凝固可干扰反定型红细胞凝集的判断。③分型血清质量性能应符合商品合格试剂的要求，标准血清效价太低，亲和力不强可能导致假阴性；试剂试验结束后应放置冰箱保存，以免细菌污染。试管、滴管、玻片必须清洁干燥，防止溶血。④凝胶卡管内有气泡和干涸现象时不可使用。血清管纤维蛋白可吸附部分红细胞，影响结果判读，应将血样离心。

2.检测中

①试管法一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。凝胶血型卡法反定管先于正定管加样，以便标准细胞与血清血浆反应，先加细胞后加血浆，以避免先加血清时血清流入凝胶层中和其中的抗体。②试剂红细胞若是自制细胞，应以3个健康者同型新鲜红细胞混合，用生理盐水洗涤3次，以除去存在于血清中的抗体及可溶性抗原。③使用试剂红细胞前应充分混匀，自制试剂红细胞也要把握浓度，红细胞悬液过浓或过淡，抗原抗体比例不适当，使反应不明显，导致假阴性。④IgM抗-A和抗-B与相应红细胞的反应温度以4℃为最强，但为了防止冷凝集的干扰，一般仍在室温（20～24℃）下进行试验。37℃可使反应减弱。⑤离心时间与速度应符合要求，定期校验离心机，以防止出现假阳性或假阴性。试管法不要混淆细胞比容和弱阳性结果（必要时可在显微镜下观察），玻片法不要混淆干燥的边缘和凝聚（注意及时判读结果）。⑥观察时应注意红细胞呈特异性凝集、继发性凝固以及缗钱状排列的区别（参见“其他疾病患者的血型检测”）。⑦ABO定型必须同时进行正反定型后，方能判断结果。观察结果时既要看有无凝集，更要注意凝集强度与凝集状态，对于正反定型不符的标本，应进一步复测（步骤同上）。

3.检测后

常见ABO正反不符原因有：生理性原因（新生儿抗原弱、老年人抗体减弱等），病理性原因（血液病、恶性肿瘤、丙种球蛋白缺乏症等）以及其他原因（如由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集，ABO亚型等）。对于ABO定型不符的结果，应按以下方案进行操作，分析具体情况对应的临床意义，保证诊断准确率：①重复做试验1次，待检者细胞用生理盐水洗涤3次，以解决与血浆蛋白或自身抗体相关的问题。②对于多次检测的待检者，本次与既往结果不符或怀疑标本有污染时，应重新采血检测。③与临床沟通，询问待检者病史，以了解可能影响ABO定型的临床情况，如疾病诊断、既往血型、输血史、移植史、目前用药等。④当反定型O型红细胞出现凝集时，将待检者血清与自身细胞和O型筛选红细胞反应，以检测可能存在的自身抗体或同种抗体。详见第二节“直接离心法检测IgM抗体”部分。检出是同种抗体的，选择相关抗原阴性的A和B细胞重做反定型；检出冷抗体抗-I、抗-IH的，可在37℃进行操作和反应，并静置1小时观察结果，而不离心。如此一般可得正反相符的结果。但要注意，37℃静置法可能漏检弱的抗-A和抗-B。⑤当正反定型凝集较弱时，可室温孵育5～10分钟后再离心以增强反应。反定型也可以通过增加血清量来增强反应。若反应仍然较弱，可能为ABO亚型或受其他因素影响，具体操作详见“ABO亚型检测方法”和“特殊情况下ABO血型的检测”。对受检红细胞做直接抗球蛋白试验可能有所帮助，操作详见第二节“红细胞结合抗体检测”。

【参考范围】

对于正常的ABO血型标本，试管法正定型阳性凝集强度应为4+，反定型阳性凝集强度尚未统一标准，上海市血液中心参比室标准为2+以上。反定型中待检血清与O细胞应不发生凝聚。

【临床意义】

ABO血型是唯一一个抗原抗体正反规律出现的血型系统，是临床输血与移植中至关重要的血型系统。ABO不合的输血可导致致命的急性血管内溶血反应。母子ABO系统血型不合可以造成ABO系统新生儿溶血病。

（二）ABO亚型检测方法

ABO亚型是具有遗传特性的，在常见的人类A、B、AB、O 4种血型之下进一步细分的弱ABO表现型。这些亚型具有明确的血清学特点，往往在ABO正反定型时出现异常反应格局。ABO亚型检测常用方法有4℃增强法，弱ABH抗原或抗体检测法，吸收放散试验，唾液ABH物质检测法和ABO基因分型技术等，后两者将在下文（三）和（四）中介绍。

【检验方法学】

1.4℃增强法

（1）原理：

当ABO定型中抗原抗体在室温凝集反应较弱时，低温下孵育可增强IgM型抗体与抗原的结合，以检测弱ABO抗原和抗体。

（2）器材：

冰箱，离心机，试管，滴管。

（3）试剂：

常规ABO血型定型试剂。

（4）操作：

将反应试管在4℃孵育15～30分钟后再离心观察结果。但为了防止冷凝集的干扰，应该做自身对照。

2.弱ABH抗原或抗体检测法

（1）原理：

采用特殊检测试剂（如人源抗-A、抗-B、抗-A，B、抗-A1植物凝集素、抗-H、A2细胞等），通过检测ABO亚型红细胞上ABH抗原以及血清中对应抗体中质和量的变化（表8-4），来鉴定ABO亚型。抗-A1不与A2细胞及其他A亚型细胞发生凝聚反应。抗-H与红细胞的凝聚强度与H抗原在红细胞上的量成正比：O ＞ A/B亚型 ＞ B ＞ A1 ＞ A1B红细胞。

（2）器材：

离心机，试管，滴管。

（3）试剂：

除外常规ABO血型检测方法的试剂，还需要人源抗-A、抗-B和抗-A，B血清，抗-A1植物凝集素，抗-H，A2试剂细胞等。

（4）操作：

当怀疑是ABO亚型时，根据具体情况滴加适当的试剂抗体1滴于干净的试管中，再滴加待检者红细胞悬液1滴；或滴加试剂红细胞1滴和待检者血清数滴，离心观察凝集强度与状态。试验中需做好阴阳对照。相应的结果判读见表8-4。

3.吸收放散试验

（1）原理：

一些ABO亚型红细胞上的A和B抗原太弱，以至于无法被试剂抗血清直接凝集；但可通过吸收人源抗-A和/或抗-B，再将其放散下来的方法证实。

（2）器材：

冰箱，离心机。

（3）试剂：

人源抗-A、抗-B血清，O型红细胞。

（4）操作：

①用生理盐水至少洗涤1ml受检比容红细胞和1ml O型红细胞（阴性对照）3次，最后一次洗涤后移除上清液。②在洗涤过的红细胞中各加入1ml人源相应抗血清抗-A或抗-B。充分混匀红细胞和抗血清，把混合物放置4℃1h，间歇混匀。③离心混合物，移除上层抗血清。用大量4℃冷盐水（10ml或更多）至少洗涤红细胞6次。④使用56℃热放散的方法，从细胞上放散出吸收的抗体。具体方法见第二节“抗体放散试验”。⑤离心，将上层放散液转入干净的试管，在试管中加入相关A或B细胞1滴，用立即离心法和4℃放置30分钟后再离心的方法，检查凝集状况。⑥结果判读与记录：受检管放散液和红细胞出现凝集，阴性对照管不出现凝集，为吸收放散试验阳性；受检管和阴性对照管均不出现凝集，为阴性。

【方法学评价】

4℃增强法和红细胞特异性抗原和抗体检测法均属于试管直接离心法，只是反应的温度、时间或使用的试剂和普通ABO定型的试管直接离心法有所区别，以利于ABO亚型的检出。吸收放散试验由于富集了1ml比容红细胞中可能吸附的抗体，因而检测弱A/B抗原的灵敏度高于普通ABO定型的试管直接离心法。

【质量保证】

（1）检测前：

①参见常规ABO血型检测前的质量保证；②吸收放散试验应使用多克隆的抗血清，因为一些单克隆抗血清对pH及渗透压的变化敏感，所以不适用于吸收放散试验。

（2）检测中：

①参见常规ABO血型检测中的质量保证；②使用4℃增强法时，若自身对照出现凝集，应多次离心，随着时间延长，温度的升高，自身冷凝集散开后，再判读结果；③吸收放散试验中，对照细胞的量应与受检细胞一致，洗涤时动作应轻柔，并将底部的比容细胞全部吹起。阴性对照管出现凝集，为洗涤未洗干净，应重做试验。

（3）检测后：

①参见常规ABO血型检测后的质量保证；②一些特殊情况下的标本报告亚型需谨慎，如新生儿、孕妇、肿瘤患者、白血病患者、近期输血史患者等。应与受检者及临床进行沟通，以了解可能影响ABO定型的临床情况。③如必要，可进一步进行分子生物学检测和采集相关家系血样进行分析。

【参考范围】

对于ABO亚型标本，除A2亚型试管法正定型凝集强度可达4+以外，其他各种亚型的凝聚强度范围在0～3+，反定型可以出现或不出现相应抗-A或抗-B抗体，正反定型不符合常规的ABO定型规律（表8-4）。

【临床意义】

若在献血者中检出ABO亚型，由于存在可能导致临床复检血型定型困难和/或配血困难的情况，一般对此类血液制品予以报废处理。若在患者输血前检查中检出ABO亚型（在排除疾病状态影响的情况下），应根据不同的亚型予以输注配合型血液和血液制品。

（三）唾液A，B，H，Lea, Leb 血型物质检测方法

约有78%的个体是分泌型，具有Se基因，它能控制分泌可溶性ABH和Lewis血型物质进入体液（脑脊液除外）。本方法是通过使用ABH和Lewis抗血清的血凝抑制试验来检测唾液中的这些血型物质。

【检验方法学】

（1）原理：

利用血凝抑制试验，把唾液或血清中可溶性ABH和Lewis血型物质和相应的抗体中和，然后加入相应指示红细胞，如果这些细胞凝集就表示唾液或血清中不含有相应的可溶性抗原，若凝集，就表示含有相应的可溶性抗原，为分泌型。

（2）器材：

离心机，水浴箱，微量移液器等。

（3）试剂：

多克隆的抗血清（如抗-A、抗-B、抗 -Lea等），抗-H植物凝集素。A1细胞，B细胞，O型和Le（a+b-）红细胞，生理盐水。已知非分泌型与分泌型唾液作为阴阳对照。

（4）操作：

①收集唾液：刷牙或漱口后，收集5～10ml唾液，900～1 000g离心8～10分钟，将上清液移入干净试管，煮沸8～10分钟以灭活唾液酶，900～1 000g离心8～10分钟，将上清液移入干净试管。②选择血型试剂稀释度：用生理盐水倍比稀释抗-A、抗-B、抗-H或抗-Lea，在每一稀释度的1滴抗血清中加入1滴相应2%～5% A，B，O或Le（a+）红细胞，离心。选择凝集强度2+的最高稀释度抗血清。③在干净的试管中各加入1滴最佳稀释度的抗-A、抗-B、抗-H或抗-Lea，同时设立“分泌型”“非分泌型”（阴阳对照）和生理盐水管（试剂对照）。在各管中再加入1滴相应唾液或血清，“盐水”管中加入1滴生理盐水，混匀置于室温8～10分钟。加入相应的2% A，B，O或Le（a+）红细胞1滴，混匀置于室温30～60分钟，离心判断结果。④结果判读与记录：出现和生理盐水对照管强度一致的凝集（阴性）表示管中没有相应血型物质；出现明显弱于盐水对照管的凝集（弱阳性）或不凝集（阳性）表示管中含有相应血型物质。

【方法学评价】

血凝抑制试验是经典的血清学方法，唾液A，B，H，Lea，Leb血型物质检测方法操作简便，不需要特殊仪器，但灵敏度有限，不能定量。

【质量保证】

1.检测前

①可以通过咀嚼石蜡或橡皮带等物促进唾液分泌，但不可使用口香糖或任何含糖或蛋白质的物质；②如果唾液在加热前不先离心并除去沉淀，则可以从可能存在的细胞中释放H物质，使非分泌型导致假阳性；③欲从唾液中得到清晰的不含有黏液的液体，可先将唾液冰冻保存数天，融化后离心，除去细胞碎屑。

2.检测中

①用已知分泌型和非分泌型人的唾液作为试验的对照。对于ABH物质测定，使用经检验为Se和sese人的唾液；对于 Lewis试验，使用 Le（a+b-）或 Le（a-b+）表现型的人红细胞作为阳性对照。阴性对照是Le（a-b-）的红细胞。试剂对照用盐水。②可以使用唾液的连续盐水稀释法来做血型活性物质的半定量测定，除去已知活性所需要的稀释度愈高，存在于唾液的血型物质就愈多。必要时要在与抗体孵育前稀释唾液。

3.检测后

缺乏Le基因的个体（lele），红细胞Lewis表型为Le（a-b-），无法通过检测Lewis血型物质来推测分泌状态；具有Le基因的个体（LELE或LEle），唾液中检出Le（b），未检出 Le（a）物质的为分泌型；同时检出 Le（a）和Le（b）物质为弱分泌型；检出 Le（a），未检出 Le（b）物质的为非分泌型。

【参考范围】

（唾液ABH血型物质检测法）分泌型：阳性；非分泌型：阴性；弱分泌型：弱阳性。

【临床意义】

通过测定唾液中ABH和Lea，Leb血型物质，可区分分泌型、弱分泌型（Sew）与非分泌型。相对其他人种，弱分泌型个体在亚洲人中较为常见。确定个体的分泌型状态，对孟买血型与类孟买血型的鉴别诊断尤其重要。类孟买血型在中国人群中的比例约为1/8 000，是一种H基因缺陷的分泌型或弱分泌型表型，孟买型血型在中国人群中极其罕见，是一种H基因缺陷的非分泌型表型。对个体分泌物中ABH的检测还有助于ABO亚型的分类及某些特殊情况下血型的鉴定。

（四）ABO基因分型技术

PCR-序列特异性引物（PCR-sequence specific primer，PCR-SSP）是目前红细胞血型分型最常用的技术之一。

【检验方法学】

1.原理

根据ABO基因核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性序列引物，通过特定的PCR反应体系扩增各等位基因的型别特异性DNA片段，产生相对应的特异性扩增产物条带，然后通过凝胶电泳检测PCR产物。根据是否产生特异性PCR产物以及产物的片段大小来指定相应ABO基因型。

2.器材

不同量程的加样器、微型离心机及平板离心机、混合器、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、微波炉。

3.试剂

ABO-SSP基因分型试剂盒，Taq DNA聚合酶，TBE电泳液，琼脂糖，荧光染料或溴乙锭染料。

4.操作

以下是SSP方法的基本步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。

（1）样本的采集与保存 采集受检者抗凝静脉血至少3ml。

（2）基因组DNA提取 采用商品化的DNA提取试剂盒。DNA纯度OD 260nm/OD 280nm比值应在1.6～1.8，根据所用的分型试剂盒的要求来调整模板DNA浓度。

（3）PCR扩增 反应体系含有特异性引物及内对照引物、PCR buffer（含 Mg2+）、dNTP、Taq 酶及模板 DNA，反应体积通常为10～25ml。扩增条件包括DNA变性、退火与延伸三组循环和保温条件。

（4）PCR产物电泳及照相 2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入0.5mg/ml溴乙锭；电泳缓冲液通常为 0.5×TBE；电泳后在紫外线灯下成像。因溴乙锭有毒，目前逐渐被DNA荧光染料取代，电泳前在PCR产物中加1ml 100×DNA荧光染料SYBRGreen I Nucleicgel Stain，电泳后在紫外光下成像。

（5）结果判断 阴性对照孔应无阳性条带，证实反应体系未被污染；每个反应孔均应出现一条内对照条带，证实反应体系准确无误，当出现另一条扩增条带，且片段大小与对应的反应孔相符，则该条带为特异性扩增条带。通过试剂盒所配的分析软件或通过反应格局表来判读结果。

【方法学评价】

血型SSP基因分型方法具有迅速、简便、特异性好和灵敏度高的特点。但该方法不适用于一些异质性较强的亚型。

【质量保证】

以下是SSP方法通用的质量保证。

1.检测前

①实验中所涉及的仪器多属于精密仪器，需校正后方可使用；②标本用EDTA或枸橼酸抗凝，标明姓名及采样日期，一部分于-20℃以下冰箱作为备份标本保存，其余用于提取DNA。

2.检测中

①基因分型操作的全过程应严格遵守防污染的规章制度；要有监控污染的措施。②每份检测设立阴性对照，以防止DNA污染出现假阳性；以内对照条带来防止假阴性。若无反应带或反应带弱，可能是DNA量不足或存在PCR抑制剂；或是Taq酶量不足；或是染料量不足；或复性温度过高。③若有假阳性带，可能是DNA量过多；或是DNA不纯或污染；或是Taq酶量过多，复性温度过低。④若阴性孔中出现反应带，可能是DNA污染，或PCR程序输入错误。

3.检测后

①若检测结果不符合反应格局，而阴性对照孔未被污染时，排除样品DNA的污染，可能的原因是新等位基因，可进行进一步测序分析；②样本量大时，对已经完成的检测标本须按一定比例抽检，采用不同的分型试剂复检，以保证样本检测的准确性。

【临床意义】

ABO基因分型方法经证实可辅助进行近期输血史、自身免疫性溶血性贫血患者的ABO定型以及某些特殊情况下（如部分亚型、痕量血液、干血点等）的ABO血型鉴定。在血清学方法对上述情况下的样本无法准确鉴定的情况下，基因分型方法可以起到有益补充的作用。

（五）特殊情况下ABO血型的检测

在冷凝集素综合征、自身免疫性溶血性贫血、白血病、多发性骨髓瘤等疾病状态或有近期输血史的情况下，患者ABO血型鉴定可能受到干扰，可通过下述方法进行ABO血型鉴定。

【检验方法学】

1.近期输血史患者的血型检测

（1）原理：

有近期输血史的患者可能由于输注了与自身红细胞不同型的红细胞而在鉴定血型时出现混合视野，可用毛细管离心的方法从自身红细胞中分离输注的红细胞。新生成的自身红细胞通常相对于输入的红细胞来说，具有更低的比重，因此，当红细胞置于毛细管中离心时，将集中在毛细管的顶端（近心端）。这种方法可以从近期输血的患者血样中获得自身红细胞。

（2）器材：

毛细管离心机，封闭物质，毛细玻璃管。

（3）试剂：

生理盐水。

（4）操作：

①用盐水三洗红细胞，末次洗涤1 000g离心5～15分钟。去尽上清液，彻底混匀；②将三洗混匀的红细胞装入10根毛细管中，装至60mm刻度；③用密封物质封闭毛细管一端；④离心15分钟（封闭端置于远心方向）；⑤割下毛细管顶端和底部各5mm的红细胞，顶部红细胞成分密度最低因而也最年轻，为患者红细胞；底部红细胞密度最高因此最陈旧，为献血者红细胞；⑥将割下的毛细管分别置于大试管中，加入盐水，充分摇动将毛细管中的红细胞冲出。然后1 000g离心1分钟，去除空玻璃管；⑦将红细胞配制成2%～5%红细胞悬液即可进行血型检测。

2.红细胞致敏冷抗体时的血型检测

待检细胞若致敏了IgM类的冷抗体，可导致盐水介质下出现自凝，干扰ABO血型鉴定。可通过热放散的方式，获得没有IgM抗体致敏的红细胞，随后再进行ABO血型检测。参见第二节第二部分“抗体放散试验”。

3.红细胞致敏IgG抗体时的血型检测

待检细胞若致敏了IgG抗体，可能导致ABO正定型或其他使用抗人球法进行的血型鉴定出现假阳性。可通过热放散法、氯喹放散法和酸放散法的方式，获得没有IgG抗体致敏的红细胞，随后再进行血型检测。参见第二节第二部分“抗体放散试验”。

4.其他疾病患者的血型检测

多发性骨髓瘤和高球蛋白血症患者血清中蛋白质浓度异常增高或比例改变，病理性球蛋白含量的增加常引起反定型红细胞盐水假凝集，这种蛋白凝集随温度变化不明显，镜下呈缗钱状排列，可通过添加适量盐水消除。区分这种缗钱状凝集和真凝集也可离心后去除试管中的血清，保留细胞扣，添加和血清量相对的盐水重悬细胞后，离心观察结果。

白血病患者造血细胞的恶性病变常导致ABO定型时A和/或B抗原减弱或出现混合视野，可通过检查ABO基因型确定。

丙种球蛋白缺乏症患者血清中缺乏应有的抗-A及（或）抗-B抗体，可导致A型、B型和O型此类患者ABO定型出现正反不符。可通过检查ABO基因型确定。

【方法学评价】

毛细管离心方法对S血红蛋白（镰刀状红细胞贫血患者）或者球形红细胞血症患者的分离细胞效果不明显。毛细管离心方法对于网织红生成障碍的患者效果不佳，只有当患者的网织红达到或超过正常水平，该分离方法才有效。

【质量保证】

1.检测前

①参见常规ABO血型检测前的质量保证；②毛细管离心法中，如果在输血3天后采血进行分离，比刚刚输血后血样的分离效果更好。

2.检测中

①参见常规ABO血型检测中的质量保证；②毛细管离心法中，装毛细管时应该不断混匀红细胞。在将毛细管放入毛细管离心机时，应放置平整，并小心旋紧盖子，以免离心时毛细管破裂或旋盖子时压碎毛细管。离心后截取两端的部分应该尽可能短，以免新旧红细胞分离效果不佳。

3.检测后

①参见常规ABO血型检测后的质量保证；②毛细管离心法中，一些红细胞抗原在新生红细胞上的表达不如年老红细胞。特别需要注意的是E，e，c，Fya，Jka以及Ge抗原；③白血病患者ABO定型异常时，应建议患者疾病缓解后复查血型；④丙种球蛋白缺乏症患者ABO定型异常时，可结合病史和基因分型方法给出血型结果。

【参考范围】

根据患者疾病状态，可出现不同程度ABO正反定型凝集强度的减弱或凝集状态的改变（如混合视野）。

【临床意义】

通过上述介绍的多种方法，尽量去除特殊情况或疾病状态对患者红细胞定型的影响，保证患者血型鉴定的准确性，对患者同种抗体的鉴定和安全输血具有重要意义。

二、Rh血型检测

（一）常规Rh血型检测方法

Rh血型系统抗原主要有5种：C、c、D、E、e。其中D抗原的抗原性最强，常规的Rh血型检测一般只作D抗原的血型鉴定，必要时也进行C、c、E、e抗原的检测。除外ABO血型的鉴定是结合正反定型来判断以外，包括Rh血型在内的其他血型系统，均仅需要鉴定红细胞上是否含有相应抗原即可鉴定血型。

【检验方法学】

1.试管直接离心法

（1）原理：

利用血凝反应原理，IgM型Rh系统抗血清特异性抗体和有相应Rh血型系统抗原的红细胞在液体介质中直接反应，并通过离心力加速反应，出现肉眼可见的凝集。

（2）器材：

小试管，离心机。

（3）试剂：

生理盐水；单克隆抗-D、抗-C、抗-c、抗-E和抗-e试剂血清。

（4）操作：

①除使用的抗血清不同外，其他操作参见常规ABO正定型的试管直接离心法；②结果判读与记录，凝集强度判读见表8-1，检测C、c、D、E、e抗原出现强凝集结果即为相应表型阳性；检测D抗原出现不凝集结果，应进一步检查排除弱D（见RhD阴性确认和变异型检测方法）；检测C、c、E、e抗原出现不凝集结果，按相应表型阴性判读。若只与抗-D血清凝集，而与抗-C，抗-c，抗-E和抗-e都不凝集，则受检者为Rh缺失型，以-D-表示。

2.玻片法

（1）原理：

利用血凝反应原理，IgM型Rh系统抗血清特异性抗体和有相应Rh血型系统抗原的红细胞在液体介质中直接反应，通过抗体的力量凝集红细胞而无离心力加速反应，出现肉眼可见的凝集。

（2）器材：

竹签，玻片。

（3）试剂：

同试管直接离心法。

（4）操作：

①分别滴加1滴抗-D或Rh其他抗血清于清洁的玻片上，再各加受检者红细胞悬液1滴（浓度参照抗血清试剂说明书），混匀；②结果判读与记录，2分钟末观察结果，强凝集（或溶血）为阳性反应，均匀细胞悬液为阴性结果。检测D抗原出现不凝集结果，应进一步检查排除弱D（见“RhD阴性确认和变异型检测方法”）。

3.微量板法

（1）原理：

同试管直接离心法。

（2）器材：

同ABO定型微量板法的器材。

（3）试剂：

同试管直接离心法。

（4）操作：

①除使用的抗血清不同外，其他操作参见常规ABO正定型的微量板法；②结果判读与记录，红细胞出现凝集和/或溶血为阳性；红细胞均匀悬浮为阴性。检测D抗原出现不凝集结果，应进一步检查排除弱D（见“RhD阴性确认和变异型检测方法”）。

4.微柱凝胶血型卡法

（1）原理：

同ABO定型微柱凝胶血型卡法。

（2）器材：

专用微柱凝胶离心机，微量加液器。

（3）试剂：

生理盐水，微柱凝胶血型卡。

（4）操作：

①按试剂说明配制好检测样本的红细胞悬液和试剂红细胞悬液；②按试剂说明在Rh定型的微柱凝胶检测管中加入试剂红细胞悬液；③按试剂说明在专用微柱凝胶离心机中离心；④结果判读与记录，出现凝集和/或溶血结果为阳性，不凝集为阴性。微柱凝胶法凝集强度判读见表8-3。

【方法学评价】

常规Rh血型检测方法基本与常规ABO血型检测方法类似，玻片法不适合进行弱D型检测。

【质量保证】

1.检测前

参见“常规ABO血型检测前的质量保证”。

2.检测中

①试管法一般应先加血清，然后再加红细胞悬液，以便容易核实是否漏加血清。凝胶血型卡法反定管先于正定管加样，以便标准细胞与血清血浆反应，先加细胞后加血浆，以避免先加血清时血清流入凝胶层中和其中的抗体。②离心时间与速度应符合要求，定期校验离心机，以防止出现假阳性或假阴性。试管法不要混淆细胞比容扣和弱阳性结果（必要时可在显微镜下观察），玻片法不要混淆干燥的边缘和凝聚（注意及时判读结果）。

3.检测后

①对于多次检测的待检者，本次与既往结果不符或怀疑标本有污染时，应重新采血检测；②确定标本无误后，应与临床沟通，询问待检者病史，以了解可能影响Rh定型的临床情况，如疾病诊断、既往血型、输血史、移植史、目前用药等。

【参考范围】

Rh抗原阳性均为2+～4+凝集强度，RhD凝集强度低于2+可能为D变异型，不凝集可能为阴性或D变异型，需进一步试验确认。

【临床意义】

同ABO血型一样，RhD血型是献血者和受血者必须检测的血型。RhD抗原具有较强的免疫原性，C、E的抗原性也很强，经免疫刺激产生Rh同种抗体的个体，在下一次输入Rh抗原阳性红细胞时引起输血反应。产生了Rh血型抗体的孕妇，孕育Rh血型不相合的胎儿时，可导致胎儿溶血（Rh系统新生儿溶血病）。

（二）RhD阴性确认和变异型检测方法

某些D变异型（variants of D，Dv）红细胞的D抗原在盐水介质反应中与IgM单克隆抗-D呈阴性结果，而在和经选择的人源多克隆IgG抗-D血清或IgG+IgM型Rh定型试剂进行的抗球蛋白方法试验中呈阳性反应。

【检验方法学】

1.抗球蛋白法

（1）原理：

Dv红细胞上的D抗原一般较弱，无法在盐水介质中通过IgM抗-D直接检测。使用不完全抗-D致敏红细胞，再加入抗球蛋白试剂，抗球蛋白分子的Fab片段与包被在红细胞上的抗-D抗体Fc段结合，从而通过抗球蛋白分子的搭桥造成红细胞的凝集，增加了检测灵敏度。

（2）器材：

离心机。

（3）试剂：

抗-D血清（并非每种抗-D血清均适合进行D变异型检测，使用前请参阅试剂说明书）；抗球蛋白试剂；生理盐水。

（4）操作：

①在洁净的试管中分别加入抗-D血清和质控试剂1滴，再加入待检者盐水悬浮的2%～5%红细胞1滴；②混匀，根据试剂供应商说明书，置37℃水浴10～30分钟，用生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将上清液除尽，并用滤纸将附着于管口的盐水吸去；③每管各加适当浓度抗球蛋白试剂1滴，混匀，1 000g离心15秒，观察结果；④结果判定阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集；受检管凝集则表明在红细胞上检出D抗原，为Dv型。不凝集则表明在红细胞上未检出D抗原，为RhD阴性；⑤在抗人球试验阴性的试管中添加1滴IgG致敏的质控细胞，以验证结果的有效性。

2.微柱凝胶法

（1）原理：

当IgG抗-D抗体和Dv红细胞反应，红细胞发生致敏，离心时微柱凝胶中的抗球蛋白凝集致敏的红细胞，使凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应。未凝集的红细胞则通过凝胶或小玻璃珠的间隙沉积在微柱凝集检测管的底部，呈阴性反应。

（2）器材：

微柱凝胶离心机，微量加液器。

（3）试剂：

凝胶卡配套试剂（抗人球卡、BLISS等），抗-D血清（并非每种抗-D血清均适合进行D变异型检测，使用前请参阅试剂说明书）；生理盐水。

（4）操作：

①按试剂说明配制好检测样本的红细胞悬液；②按试剂说明在对应的微柱凝集检测管中加入样本的红细胞悬液，再加入抗-D定型血清或质控试剂；③按试剂说明孵育和在专用微柱凝胶离心机中离心；④结果判读与记录，微柱凝胶法凝集强度判读见表8-3，结果判读同“1.抗球蛋白法”。

【方法学评价】

本方法使用IgG型抗-D结合间接抗人球试验对直接离心法无法检出的D变异型进行血清学鉴定，提高了检测灵敏度。但抗人球试验使用的是试管法，灵敏度低于微柱凝胶法。另外，使用微柱凝胶介质进行抗人球试验无需洗涤红细胞，减少了程序和时间，适合大量样本的检测。微柱凝胶法还具有标本用量少、标本可长期保存等优点。

【质量保证】

1.检测前

参见“常规ABO血型检测前的质量保证”。

2.检测中

①严格遵照抗血清供应商说明书操作，如抗血清和细胞间的比例以及温育的温度和时间等。②在加入细胞悬液之前，必须检查试管中有无抗血清，以免试管中漏加抗血清。③使用人源抗-D血清时，阴性对照出现阳性结果，应考虑待检者细胞是否为多凝集红细胞，后者与任何成人血清都会发生凝集。④假阳性结果还可由于样品中的自身凝集和异常蛋白质引起，应将细胞充分洗涤后再做试验。对受检红细胞做直接抗球蛋白试验，阳性时从红细胞表面去除IgG抗体，可能有所帮助，操作详见第二节第二部分。

3.检测后

①对于多次检测的待检者，本次与既往结果不符或怀疑标本有污染时，应重新采血检测；②一些特殊情况下的标本报告Dv型需谨慎，如肿瘤患者、白血病患者、近期输血史患者等，应与受检者及临床进行沟通，以了解可能影响Rh定型的临床情况；③如必要，可进一步进行分子生物学检测和采集相关家系血样进行分析。

【参考范围】

±～4+凝集强度（抗球蛋白法及微柱凝胶法）。

【临床意义】

1.在临床输血中，弱D型人经输注D阳性红细胞后可产生抗-D抗体。所以受血者若为弱D型，应作Rh阴性论，应输注Rh阴性血液；供血者为弱D型者，应作Rh阳性论，不应当输血给Rh阴性的受血者。

2.弱D型妇女与Rh阳性丈夫生育的婴儿可能发生新生儿溶血病。

3.检测DEL的血清学技术是吸收放散试验，也可通过基因分型进行检测。DEL表型的红细胞几乎不会使Rh阴性受血者产生抗D，因此目前没有明文规定要求血站在Rh阴性献血者中筛查DEL表型。

（三）Rh基因分型技术

Rh基因分型方法与ABO基因分型方法基本相同，为PCR-SSP方法，参见ABO基因分型技术。

（四）红细胞其他血型检测

目前发现的红细胞血型系统有30余种，检测方法大体可分为血清学检测方法和基因分型方法。在血清学检测方法中，如果血型鉴定使用的抗血清试剂为IgM型，使用直接离心的方法检测（参见“常规Rh血型检测方法”）；若抗血清试剂为IgG型，需用间接抗人球方法检测（参见“间接抗球蛋白试验”部分）。对于稀有血型系统，抗血清往往不易获得，可通过基因分型方法进行血型检测（参见“ABO基因分型技术”）。

（五）特殊情况下Rh及其他红细胞血型的检测

参见前述“特殊情况下ABO血型的检测”方法，对致敏冷抗体或IgG抗体的红细胞、近期输血史患者的红细胞以及其他疾病患者的红细胞进行Rh及其他血型的检测。

三、白细胞血型检测

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分型技术已经从传统血清学扩展到现代分子生物学，从细胞水平的检测扩展到基因水平，其应用也日益广泛。

（一）人类白细胞抗原血清学分型方法

HLA-A、B、C、DQ和DR可以用微量淋巴细胞毒试验检出，检测HLA-D、DP的细胞学方法基本已被基因分型方法取代。

【检验方法学】

1.原理

先通过密度梯度离心的原理从外周全血中分离淋巴细胞。淋巴细胞膜表面具有HLA抗原，HLA特异性抗体与淋巴细胞膜上相应的HLA抗原结合，激活补体，从而改变了细胞膜的通透性，采用染色法着色，染料进入到细胞中；如淋巴细胞不带有相应的抗原，则细胞膜完整，染料无法进入。在显微镜下估计着色细胞的百分比来判断抗原、抗体反应的强度。HLA-Ⅰ类抗原用T细胞或混合淋巴细胞检测，HLA-Ⅱ类抗原用B淋巴细胞检测。

2.器材

17mm×100mm 试管；1μl、5μl连续加　样　器；水平离心机；72孔微量淋巴细胞毒实验反应板；倒置相差显微镜。

3.试剂

淋巴细胞分离液；肝素或ACD抗凝剂；生理盐水或其他平衡盐溶液（磷酸盐缓冲液PBS、Hanks液等）；Terasaki液或RPMI-1640组织培养液；兔补体；5%的曙红水溶液；12%的甲醛溶液；HLA分型血清。

4.操作

①首先，分离淋巴细胞。抽取外周静脉抗肝素或ACD抗凝血3～5ml，以2 000r/min离心10分钟；吸取2ml白膜层至容量17mm×100mm试管中，试管内先放入250mg羰基铁粉、3～4ml预温至22～37℃含10g/L甲基纤维素的PBS；在上述试管中放入6～7颗玻璃珠，加盖后置37℃培养10分钟，并使用专用仪器不断旋转颠倒混匀血液；去盖后直立试管，用磁铁将铁粉吸至底部，并在37℃中静置15分钟；取出富含白细胞的血浆层，加在3ml淋巴细胞分离液上，2 000rpm/min离心20分钟。将界面白膜层细胞转移至装有PBS的试管中。混合后以1 000rpm/min离心5分钟；吸去上清液，细胞用1ml含有5%（V/V）小牛血清的McCoy液重悬浮，即可得混合淋巴细胞。做HLA-Ⅰ类抗原分型时可调整细胞浓度为2×106/ml备用。做HLA-Ⅱ类抗原分型时需进一步使用尼龙棉柱法或免疫磁珠法分离B淋巴细胞。②随后进行微量淋巴细胞毒试验。在72孔微量反应板中，每孔加液体石蜡1滴（8ml），每孔加HLA分型血清1ml，淋巴细胞悬液1ml。（22±2）℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育30分钟，B淋巴细胞放置60分钟。每孔加兔补体5ml，（22±2）℃下，T细胞或混合淋巴细胞孵育60分钟，B淋巴细胞放置120分钟。每孔加入5%曙红溶液3ml，染色5分钟。每孔加入12%的甲醛溶液8ml，固定和终止反应。静止4小时以上或过夜，盖上载玻片看结果，紧急情况下可54g离心判断结果。③结果判断时，读板从1A→1F，然后2F→2A，依次进行，直至12A。在倒置相差显微镜下，被染色的细胞即死细胞，细胞肿胀，无折光能力，呈黑灰色；未被染色的细胞即活细胞，折光能力强，呈光亮状。以美国国家卫生研究院（NIH）方法为准，按照死细胞所占比例来判定每一孔的反应结果（表8-5）。根据试剂盒所提供的反应格局表判读HLA血清学分型结果。

【方法学评价】

血清学技术是发现HLA的基础，在单克隆HLA试剂应用以后，血清学方法对HLA-Ⅰ类抗原分型仍然具有较强的生命力。但HLA-Ⅱ类抗原由于某些疾病原因而错检，某些特异性抗原因缺少单价抗血清而发生分型困难，需用基因分型来纠正。

【质量保证】

1.检测前

肝素和淋巴细胞分离液使用前应平衡至室温，过冷将影响分离液的比重，造成红细胞污染，并且容易使血小板和淋巴细胞发生聚集。

2.检测中

整个分离过程中，应控制温度在22～25℃。尽可能除去血小板，以免影响淋巴细胞毒试验结果。每块反应板应设立阴性对照（阴性对照血清一般采有AB型男性、无受血史者血清）和阳性对照（阳性对照孔中加入了抗淋巴细胞球蛋白）。

【临床意义】

准确的HLA分型对临床进行造血干细胞移植和器官移植患者的组织配型、骨髓库的建立与发展、免疫性疾病的研究等具有重要意义。HLA配型能显著改善移植物的存活，减少免疫抑制药物的使用。另外，HLA型别与疾病有一定关联，如HLA-B27与强直性脊柱炎相关。HLA分型还用于法医鉴定等方面。

（二）人类白细胞抗原基因分型技术

近年来随着分子生物学飞速发展，HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原分型技术不断完善，出现了多种检测HLA高度多态性的分型技术。

【检验方法学】

1.PCR-SSP法HLA分型

（1）原理：

采用PCR-SSP技术，使用序列特异性引物，通过PCR反应特异性扩增HLA基因片段。然后用凝胶电泳检测PCR产物片段的长度，根据PCR产物的反应格局来指定相应基因型。

（2）器材：

不同量程的加样器、微型离心机及平板离心机、混合器、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、微波炉。

（3）试剂：

HLA SSP基因分型试剂盒，Taq DNA聚合酶，TBE电泳液，琼脂糖，荧光染料或溴乙锭染料。

（4）操作：

SSP方法的基本步骤和结果判读参见“ABO基因分型SSP方法”的步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。

2.直接测序法

（1）原理：

直接对HLA基因的DNA片段进行序列分析来确定等位基因，通常分两步进行：先用SSP等方法对样本作HLA初步分型，然后根据其HLA型别，使用PCR-SSP方法扩增某基因的特定外显子区域，得到PCR扩增产物，然后测定纯化的PCR产物DNA序列。直接测序法是用4种荧光染料标记的双脱氧核糖核苷酸与模板DNA末端碱基在PCR循环过程中结合后，在高分辨力的PAGE凝胶电泳中，计算机自动记录碱基序列，并以4种不同的颜色来表示。

（2）试剂：

HLA测序试剂盒，2%的琼脂糖凝胶。

（3）器材：

PCR扩增仪、DNA测序仪。

（4）操作：

①根据试剂盒说明书中的比例加样Taq酶与扩增反应混合液；②振荡混匀后将Taq酶混合液按说明书要求的体积加入到每个PCR反应孔中；③在每个反应孔中加入基因组 DNA（50ng/μl）或无菌水（阴性对照），混匀、离心；④按说明书建立PCR反应体系，将PCR反应孔放入PCR仪进行扩增；⑤取3μl PCR产物，2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR成功与否，PCR成功后继续以下步骤；⑥按说明书要求将PCR产物用消化酶消化；⑦将消化后产物进行测序反应，按说明书要求在每个反应管中分别加入适量测序混合液（包括引物和Big Dye染料），并分别加入适量相应的PCR消化后产物，运行说明书指定的热循环程序；⑧反应结束后，用乙醇纯化测序产物，具体参照说明书要求；⑨准备测序电泳样本，在每个测序反应孔加入适量试剂盒中的HiDi-Formamide，简短离心，在热循环仪上运行95℃变性2分钟；⑩将测序反应管放在测序仪上进行测序，测序结束，按照试剂生产商提供的软件进行分析。

3.多荧光微珠免疫分析

（1）原理：

是基于荧光流式细胞仪和免疫标记技术相结合的一项免疫学技术，包含HLA位点的PCR产物与有色微球上的DNA探针进行杂交。微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可获得100种不同颜色的微球，每种颜色的微球可以携带一种HLA型别的DNA探针。分析仪将微球排成单列通过检测通道，并使用双色激光同时对微球内的红色分类荧光和DNA探针上（与探针杂交的单链PCR产物标记有荧光基团）的绿色报告荧光进行检测。通过检测微球上DNA探针的荧光强度来判定微球上是否结合了PCR产物，通过测定微球的颜色来判定结合的PCR产物的特异性，经分型软件分析可确定样品的HLA型别。

（2）器材：

PCR仪，平板离心机，96孔扩增板。

（3）试剂：

Luminex HLA分型试剂盒。

（4）操作：

①将样本DNA、扩增试剂置于室温至完全溶解；旋涡振荡扩增试剂和样本DNA，离心；取适量 DNA加入相应反应孔的底部，设置一孔不加入DNA模板作为阴性对照，及时盖上封板膜，防止挥发和污染；在PCR专用加样室或超净台中配制扩增反应混合液。②盖紧离心管，旋涡振荡混匀，每孔加入适量扩增反应混合液，贴好封口膜，漩涡振荡混匀，离心。③将上述加好样的扩增板置于PCR仪中，按说明书指定程序扩增。扩增完成后，取3μl扩增产物以2%琼脂糖凝胶预电泳，PCR成功后继续以下步骤。④样本杂交：按说明书要求预热试剂，设置PCR仪预热程序，变性。将每孔的PCR扩增产物一一对应加至杂交板，贴上膜，离心，振荡混匀，离心后室温孵育。⑤按说明书要求配制含有微珠的杂交混合液；先在每孔加适量中和缓冲液，振荡混匀，离心。再在每孔加相应的杂交混合液。将杂交板用膜密封好后，低速充分振荡混匀，PCR仪60℃孵育15min。⑥杂交结束后从PCR仪上取下杂交板，每孔立即加适量洗涤液，洗涤两次。⑦按说明书配制荧光液，在反应孔中加入荧光液，覆膜，密封后，低速振荡充分混匀。⑧PCR仪60℃孵育6分钟，从PCR仪上取下杂交板，洗涤一次，每孔加适量洗涤液，吹打混匀后转移到读板上。⑨通过Luminex仪器和计算机系统读取数据，分析确定样品的HLA型别。

【方法学评价】

HLA-SSP方法快速、简便、成本低、特异性高，耗时较短，分辨率可从低到高，适合于小批量标本，对需要快速分析的肾移植尤其适宜。缺点是不宜自动化，不能检测新的等位基因等。DNA序列分析和PCR直接测序无疑是目前HLA基因分析最可靠、最准确和最彻底的方法，但测序技术较为复杂，操作较繁琐，检测时间较长，作为器官移植临床配型尚有较大难度。此外，包括骨髓移植在内的器官移植，并不需要测序分析如此精确和精细的分型。多荧光微珠免疫分析方法极大简化了临床检测程序，减少了临床检测成本，同时保持了荧光流式细胞仪所具备的准确性、敏感性、特异性和重复性以及快速出结果等优点，但仪器价格比较昂贵。

【质量保证】

1.PCR-SSP法HLA分型

参见“ABO基因分型技术”中介绍的PCR-SSP法质量保证。

2.直接测序法

每次PCR前，准备新鲜的PCR/Taq酶混合液。操作⑦中加入乙醇沉淀时，应充分混匀，不完全混合将影响测序质量。

3.多荧光微珠免疫分析

注意贴封板膜时，擀压数次尤其注意板的四周以确保封板膜紧密粘贴在反应板上，以防止反应液的蒸发、确保实验的正常进行。进行杂交时，杂交液和荧光液均对光敏感，需避光储存。荧光染色后，如果不立即上机读取，可用封板膜封好后在4℃储存（避光）3天。

【临床意义】

同HLA血清学分型方法的临床意义。

四、血小板血型检测

（一）血小板特异性抗原基因分型技术

在绝大部分血小板特异性抗原（HPA）中，编码抗原等位基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）或碱基缺失（如HPA-14）导致HPA的同种异型。PCR-SSP方法是目前血小板血型分型最常用的技术之一。

【检验方法学】

1.原理

根据血小板糖蛋白基因和HLA基因核苷酸碱基序列的多态性和已知的DNA序列，设计一系列等位基因型别特异性序列引物，通过PCR反应特异性扩增HPA和HLA基因片段。然后用凝胶电泳检测PCR产物片段的长度，根据PCR产物的反应格局来指定相应基因型。

2.器材

不同量程的加样器、微型离心机及平板离心机、混合器、PCR扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪、微波炉。

3.试剂血小板

SSP基因分型试剂盒，Taq DNA聚合酶，TBE电泳液，琼脂糖，荧光染料或溴乙锭染料。

4.操作

SSP方法的基本步骤和结果判读参见“ABO基因分型SSP方法”的步骤，具体操作按所使用的试剂盒说明书进行。

【方法学评价】

由于血小板特异性抗原对应的抗血清不易获得，因此血型SSP基因分型方法较血清学分型在临床使用更广泛，成为血小板血型鉴定的常用方法，其具有迅速、简便、特异性好和灵敏度高的特点。不需要特异性抗体和血小板，可用尿沉淀物、口腔黏膜细胞和羊水细胞作为基因组DNA的来源。

【质量保证】

同ABO-SSP方法的质量保证。

【参考范围】

参照试剂盒说明书。

【临床意义】

对于血小板输注无效和输血后紫癜的患者，选择血小板和HLA配合型献血者，能获得较好的输注效果。

（二）血小板特异性抗原血清学分型技术

血小板特异性抗原血清学分型技术包括致敏红细胞血小板血清学试验、单克隆抗体免疫固定血小板抗原试验和单克隆抗体固相血小板抗体试验（见“第二节血小板抗体检测”）等，但由于特异性的抗血清不易取得，因此血小板血清学分型方法目前在临床工作中较为少用。

五、血清蛋白型检测

血清蛋白型是指血清中蛋白质所具有的遗传多态性，其中免疫球蛋白型研究较为深入。此处着重介绍使用较多的ELISA方法和近年新发展的颗粒凝胶免疫法在检测IgA同种型方面的应用。微量血凝抑制试验检测Ig同种异型，由于需要特殊的抗Ig同种异型的抗体，因此一般实验室较少检测本项目。这里仅做简单介绍。

（一）酶联免疫吸附试验

【检验方法学】

1.酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）原理

在测定标本IgA时，将受检标本与固相载体包被的抗-IgA反应。用洗涤的方法使固相载体上形成IgA-抗IgA复合物与液体中的其他物质分离，再加入酶标的抗-IgA，此时固相上的酶量与标本中IgA的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

2.器材

96平底微板，水浴箱，酶标仪，微量加样器。

3.试剂

抗-IgA抗体，人标准血清，辣根过氧化物酶偶联抗体，包被缓冲液，封闭液，底物显色液TMB，终止液，20×PBS缓冲液，吐温Tween-20。

4.操作

①血液标本的稀释：吸取献血者血液样本管中上层血清1μl/份加入 0.9% NaCl溶液中（1：10 000稀释），混匀，待检。②固相包被板的制备：将抗-IgA抗体在包被缓冲液中按1：200比例稀释，加入96孔平底微板中，每孔100μl，封板，置于4℃冰箱过夜。次日每孔加0.05% T-PBS（由20×PBS和吐温Tween-20配制而成，吐温质量分数为0.05%）300μl/孔，洗涤三次，扣干后加入200μl/孔封闭液。将微孔板置于37℃水浴箱孵育，30分钟后取出，重复洗涤三次。待板扣干后密封存于4℃冰箱备用。③标准曲线制备：将人标准血清试剂（IgA含量为1mg/ml）稀释获得已知浓度的IgA以使试验标准化。具体方法：先将人标准血清在0.05%T-PBS中按照 1：1 000稀释，再按 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64和1：128作倍比稀释，最终IgA含量为（500～7.8）ng/ml。每次试验前新鲜配制。④血清IgA检测：将步骤③中不同稀释梯度获得的已知浓度IgA溶液、待检血清标本和已知的阴性标本加入到已包被抗体的微孔板上，各加100μl/孔，并设2孔空白对照；将板放入湿盒中置于37℃水浴温育1小时（或室温下2小时）后取出板，加入300μl 0.05% T-PBS洗板5次，加入 100μl/孔辣根过氧化酶偶联抗体（1/50 000 稀释，1mg/ml）；37℃水浴1小时取出重复上述洗板步骤后，加100μl/孔底物显色液TMB，在黑暗环境中反应8～10分钟，加50μl/孔终止液终止反应。⑤结果判读与记录，在酶标仪下选择 450nm波长段读数记录。应用计算机分析得到标准液、空白对照和检测标本2孔读数的平均值（以空白对照作校正，用“均数±标准差（x±s）”表示）及置信水平（CV）；创建标准曲线，4-PL曲线拟合，每组实验都要设置标准曲线。

【方法学评价】

精度良好，灵敏度高，特异性强，成本低，无需专门的设备和仪器，适合推广及大规模检测。

【质量保证】

1.检测前

要注意避免标本出现严重溶血、脂血和细菌污染。

2.检测中

每次加不同的标本时均需更换吸嘴，以免发生交叉污染。加样时速度不可太快，避免将标本加在孔壁上部，并注意不要溅出或产生气泡；在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果；必须固定显色时间和温度等。设2孔空白对照，阳性对照及阴性对照（已知的阴性标本）。

【参考范围】

正常人 ＞ 5mg/dl，严重缺乏者 ＜ 0.05mg/dl。

【临床意义】

IgA缺乏症受血者输血后易产生抗IgA抗体，后者会导致严重的输血过敏反应。若在输血前对受血者进行IgA含量检测，对IgA缺乏症患者输注IgA（-）的献血者血液，将有助于预防输血超敏反应的发生，保证受血者的输血安全。IgA缺乏症还与多种疾病相关，如呼吸道、胃肠道感染，自身免疫病，变异型免疫缺陷症等。

（二）颗粒凝胶免疫法

【检验方法学】

1.原理

高密度合成多聚体有色颗粒上包被有人源多克隆抗-IgA抗体，将其与待检血清混合，若血清中含有IgA，则会引起这种有色颗粒发生凝集反应。反应混合物通过加入到凝胶过滤基质中离心，发生凝集的有色颗粒不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应。未凝集的颗粒则通过凝胶间隙沉积在凝胶管的底部，呈阴性反应。

2.器材

凝胶卡，离心机，微量加样器，涡旋仪。

3.试剂

IgA缺乏检测试剂盒（内含凝胶卡、指示微粒、阴性对照血清及阳性对照血清）。

4.操作

①在凝胶卡上适当位置标记待检样本名称，并设阴性、阳性对照；②血清样本解冻，离心1 500g，10分钟；③吸取10μl待检血清加入到对应微管的反应孔腔中，同时加入阴性和阳性对照；④将指示微粒悬液置于涡旋仪上轻微混匀；⑤在已加入血样标本的微管反应孔加入50μl微粒悬液；⑥将凝胶卡室温（18～25℃）孵育5分钟；离心10分钟；⑦按说明书要求观察和记录结果。

【方法学评价】

快速、简易、准确度高。

【质量保证】

血样和试剂使用之前务必达到室温；每一系列实验都要设阳性和阴性对照；冷冻或解冻状态下的血清在操作之前先离心；凝胶卡在使用之前如发现有气泡，有水滴在管壁上应先离心。

【参考范围】

严重缺乏者 ＜ 0.05mg/dl。

【临床意义】

临床输血前可快速检测严重IgA缺乏，预防IgA输血过敏反应发生。

（三）微量血凝抑制试验

可用于检测Gm、Km、Am、Em型别。一般原理是将已知同种异型的抗Ig血清［如抗Gm（1）］与待检标本混合，若待检血清中有Gm（1）型别的Ig，则发生中和反应，抗Gm（1）被中和后将不能凝集表明带有Gm（1）Ig的红细胞，使之呈阴性反应，证明该待检标本含有Ig Gm（1）。

（蔡晓红　向　东）